兔肝VX2移植瘤不同剂量高强度聚焦超声辐照后增殖细胞核抗原的表达及意义

欧霞，王雁，邹海蓉，邹建中，李崇雁

（重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆市超声医学工程重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地，重庆 400016）

高强度聚焦超声（high-intensity focused ultrasound，HIFU）技术在肿瘤的治疗中发挥了重要作用［1］，其剂量和疗效是当前研究的热点。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于细胞核中，其表达的高低和程度与肿瘤细胞增殖活性密切相关，乃目前公认的一个细胞增殖相关基因［2］。本研究检测HIFU不同剂量辐照后肿瘤及与正常组织交界的PCNA表达情况，拟探讨细胞增殖活性与HIFU辐照剂量的关系及意义，为HIFU临床疗效提供参考。

1 材料与方法

1.1 兔肝VX2移植瘤模型的建立

健康纯种新西兰大白兔72只（重庆医科大学动物实验中心提供），体质量1.5～2.0 kg，月龄2～3月，雌雄不限；VX2鳞癌细胞株瘤块（日本Funbanski公司引进，重庆医科大学超声医学研究所提供）。采用包埋法，将1 mm×1 mm×1 mm大小的瘤块植于开腹后拟接种的兔肝右中叶，止血、关腹、缝合切口，即制成荷瘤兔。

1.2 实验方法

辐照前1 d荷瘤兔禁食，前12 h禁水、备皮，术前5 min全麻后俯卧固定于手术台，腹部完全浸入脱气水。采用JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统（重庆海扶（HIFU）技术有限公司研发，治疗参数：治疗头频率为1.03 MHz，直径为158 mm，焦点处声强ISATA最高可达19894.38 W/cm2），治疗头定位肿瘤，以“线-面-体”的方式，由深至浅逐渐覆盖整个肿瘤组织，仅扫描一遍，速度为3 mm/s，两线间距4 mm，每层间距3 mm。以声功率表示该组剂量（各组实验参数相同，每只肿瘤模型每立方厘米的辐照时间相同且最短），肿瘤模型按剂量平分为9个组，每组8只。

1.3 PCNA表达的检测

辐照后24 h于靶区和肿瘤与正常组织交界处取材，PCNA免疫组化染色的具体方法按试剂盒说明进行（SABC法）。PCNA表达判断标准：每例标本随机选5张免疫组化切片，每张观察5个高倍视野，计算每个视野下100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性表达率，以百分率表示；细胞核染色呈棕色为过表达，棕黄色为强表达，黄色为弱表达，正常情况下胞质及包膜不着色。

1.4 统计学处理

统计方法采用单向方差分析、t检验及相关性分析。使用SPSS 13.0统计软件处理。

2 结果

2.1 PCNA阳性表达率

PCNA在VX2肿瘤靶区阳性率的表达随辐照剂量的增加逐渐下降；交界组织PCNA阳性率先上升后下降，功率为100 W时，阳性率最高达（23.36±7.54）%，功率至180 W时，靶区及交界组织PCNA几乎已无阳性表达（表1）。

表1 不同剂量HIFU辐照后PCNA阳性表达率的比较Tab.1 Comparison the expression of PCNA positive rate with different doses of HIFU irradiation

2.2 PCNA的表达程度及分布情况

VX2肿瘤靶区各组阳性细胞呈强表达或过表达，弥散、灶状或片状分布，阳性细胞中弱表达的比例随辐照剂量的增加而增高（图1）。交界组织阳性细胞包绕于肿瘤四周，基本为弱表达，强表达阳性细胞比例在80 W时达峰值（图2）。

图1 VX2兔肝移植瘤靶区组织PCNA免疫组化染色 ×400Fig.1 Observations of PCNA immunohistochemistry in VX2 rabbit liver tumor target tissues×400

图2 VX2兔肝移植瘤与正常组织交界处PCNA免疫组化染色 ×400Fig.2 Observations of PCNA immunohistochemistry between the junction of VX2 rabbit liver tumor and normal tissues×400

2.3 线性相关性分析

辐照剂量为自变量，PCNA阳性表达率为因变量进行相关性分析。当功率小于100 W时，VX2肿瘤靶区PCNA阳性表达率与辐照剂量呈线性负相关，r为-0.956（P<0.01）；交界组织的 PCNA 阳性表达率与剂量变化有关，但非线性相关。

3 讨论

一定强度的超声波作用于组织细胞会使其产生相应的生物学效应，效应程度取决于声波强度（声功率）［3］。本研究发现，VX2肿瘤靶区PCNA阳性细胞表达率和强表达细胞比例均随辐照剂量（功率）的增加而明显下降至不表达，肯定了HIFU的治疗效果；但肿瘤与正常组织交界处的阳性表达率和强阳性细胞表达比例却分别于100 W、80 W时达峰值，可见HIFU辐照可诱导交界处PCNA的表达。Tam等［4］观察到低强度超声声流明显，可增强细胞膜通透性和细胞内外物质交换，作者发现在42℃时能促进PCNA表达、使肝细胞增殖［5］，根据热平衡原理，超声波作用于靶区的热效应也会对靶组织周围细胞产生影响。免疫组化结果证实在较低剂量时，靶区组织空泡较少以热效应为主，并且交界处组织细胞核染色加深，而剂量增大靶区空泡也增多。

目前研究发现，低强度超声可通过促进细胞内Ca2+离子浓度瞬间增强、整联蛋白受体活化和ERK/ROCK/Rho信号途径的开放等机制使生长因子表达增强，从而刺激细胞增殖［6，7］；但有学者认为低强度超声并不能明显促进细胞生长增殖［8］。出现这种显著差异，可能和实验仪器设备、超声波辐照的参数、辐照方式、离体或者活体标本的选择及活体组织的生物学特性不同有关。本实验选用活体组织作为研究对象，以功率代替辐照剂量，结果显示PCNA的阳性表达率与超声辐照剂量之间在本实验所选剂量范围内没有完整的线性关系，但靶区和交界处组织PCNA的表达规律确和剂量变化有关，最重要的原因可能就是超声与活体组织间有信息反馈，是相互作用，并非单纯的施加和接受的关系，而且不能排除整个机体调节和邻近组织的影响。另一方面，辐照剂量（功率）继续增加，交界处组织PCNA受到抑制，其阳性表达率也最终降至0%，说明达到一定剂量时，HIFU不仅能使靶区肿瘤细胞死亡，更能抑制甚至灭活肿瘤与正常组织交界处细胞。

本实验以PCNA的变化规律作为评判方法，阐述HIFU辐照剂量和疗效的关系，不仅说明HIFU是一种有效的肿瘤治疗技术，更为临床治疗的剂量选择提供了参考依据。

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