“通脉口服液”延缓肾小管间质纤维化研究

朴胜华,杨霓之

(1.广东药学院中医药研究院,广州 510006;2.广东省中医院,广州 512120)

肾间质纤维化(TIF)几乎是所有慢性肾脏疾病进展到后期的最终结果[1].无论肾脏病原发病因和部位在肾小球、肾小管还是肾血管,大多数进展性肾病均可见到肾小管间质纤维化.大量研究表明,TIF的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切 .因此,对其发病机制及防治的研究越来越受到国内外研究者的重视.

通脉口服液由中医肾脏病专家杨霓之教授研制,具有益气活血作用,作为院内制剂最初用于治疗慢性肾炎取得了很好的临床疗效.前期课题组进行了大量的临床与实验研究,证明其在一定程度上可延缓单侧输尿管结扎(UUO)致肾小管间质纤维化,保护肾功能.本研究拟从调节纤维化细胞因子的角度,探讨其作用机理,为确立益气活血法防治肾间质纤维化提供更充分的科学依据.

1 材料和方法

1.1 药物

受试药物:通脉口服液,由黄芪、三七等组成,由广东省中医院制剂中心提供.阳性对照药:苯那普利,商品名洛汀新,北京诺华制药有限公司生产,批号:国药准字 X0267,规格为 10 mg/片.

1.2 实验动物

Wistar大鼠,雄性,体重 230～250 g,由广州中医药大学动物中心提供,合格证号:SCXK(粤)2003-0001.

1.3 模型制备

1.3.1 气虚血瘀证模型制备

衰老模型:实验第 4天至第 35天(d4～d35)各组大鼠每日皮下注射 D-半乳糖,剂量 48 mg/kg,以造成大鼠的亚急性衰老模型[2];疲劳模型:d4～d35实验大鼠每日 14:00开始分批置入直径 50 cm,高 100 cm水桶内,桶内水深约 45 cm,水温与室温均保持为(10±0.5)℃ .以木棒拔打强迫其不断游泳直到疲劳,时间长短存在个体差异,平均为(10±5)min.

1.3.2 UUO动物模型的制备

质量分数 5%的水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉后局部剃毛,常规消毒铺孔巾,选择腹正中线切口稍偏左,依次切开皮肤至腹腔,游离肾脏及输尿管,将左侧输尿管用组织钳托起中段部位,止血钳夹住,在两端用 4.0丝线结扎左侧输尿管近肾盂段及远端,在两个结扎点之间剪断输尿管,然后用 4.0丝线连续缝合肌肉、皮肤.假手术组即空白对照组(K)大鼠手术入路方式同 UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管[3].

1.4 实验分组及给药

将上述方法制备成的气虚血瘀 UUO大鼠随机分为假手术组即空白对照组(K)、模型组(M)、中药高剂量组(TMH)、中药中剂量组(TMM)、中药低剂量组(TML)、西药对照组(LTX).K、M组大鼠 37～58 d生理盐水灌胃;TMH组大鼠 37 d～58 d TM(12mL/kg·d-1)灌胃;TMM组大鼠 37 d～58 dTM(8m L/kg·d-1)灌胃;TML组大鼠 37 d～58 dTM(4 mL/kg·d-1)灌胃;LTX组大鼠 37 d～58 d洛汀新(10 mg/kg·d-1)灌胃.

1.5 标本收集与取材

d58各组大鼠腹主动脉取血制备血清,-70℃冰箱保存.梗阻侧经肾门正切的肾组织用 10%(体积分数)多聚甲醛溶液固定,常规方法制备切片待检.其余肾组织匀浆,离心后取上清.

1.6 观测指标与方法

1)大鼠肾组织 colIV、MMP-9、TIMP-1的表达:免疫组织化学法.

2)大鼠肾组织 CTGFmRNA的表达:原位分子杂交.

3)大鼠肾组织血清 t-PA、PAI含量的测定:Elisa法.

1.7 试剂及仪器

colIV、MMP-9、TIMP-1免疫组化试剂盒,CTGFmRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供;t-PA、PAIElisa检测试剂盒由美国 USCN Life Science and Technology Company生产,广州威佳科技公司提供.Leiz型轮转切片机(德国),LKB-V超薄切片机(奥地利),5320型自动闪烁 r计数仪(美国 PACKRD公司),电光源显微镜(日本 OLYMPUS),荧光显微镜(上海第二光学仪器厂).

1.8 统计方法

免疫组化和原为杂交结果用 GMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统进行分析,在显微镜(×200)分别取l5个不重复的肾小管间质视野,结果以阳性目标总面积/统计场总面积(面密度)来表示.

所有结果采用 SPSS 11.0统计软件进行统计学分析处理,计量资料采用方差分析和 q检验,结果用±S表示.

2 实验结果

2.1 对实验性 UUO大鼠肾间质colIV表达的影响

见表1.

表1 治疗后各组大鼠肾间质colIV表达的影响

2.2 对实验性 UUO大鼠肾间质 MMP-9、TIMP-1表达的影响

见表2.

表2 治疗后各组大鼠肾间质 MMP-9、TIMP-1的表达

2.3 对实验性 UUO大鼠肾间质 CTGFmRNA表达的影响

见表3.

表3 治疗后各组大鼠肾间质 CTGFmRNA的表达

2.4 对实验性 UUO大鼠肾组织 t-PA、PAI含量的影响

见表4.

表4 治疗后各组大鼠肾组织 t-PA、PA I含量

2.5 对实验性 UUO大鼠血清 t-PA、PAI含量的影响

见表5.

表5 治疗后各组大鼠血清 t-PA、PAI含量

3 讨 论

TIF是一个复杂的病理过程,是多种原因共同作用的结果,以肾间质中细胞及胶原成分聚集增多,伴有肾小管萎缩或扩张变形,小管周围毛细血管减少、荒废,完整肾单位的进行性减少及肾小球滤过率的持续性下降为特征.这一病变过程涉及细胞、细胞外基质(ECM)、细胞因子、生长因子及它们之间的相互作用[4].

TGF-β是参与肾小球硬化及肾小管间质纤维化的关键的细胞因子[5-7],但 TGF-β抑制细胞增殖,抗肿瘤和免疫调节等正面效应的存在限制了其抗体的应用.CTGF是由 TGF-β诱导产生的一种新的致纤维化蛋白,是 TGF-β的下游介质,可调节成纤维细胞的生长及成纤维细胞和系膜细胞、细胞外基质的分泌,在肾脏纤维化中也具有重要作用,是 TGF-β致前纤维化的标志[8].因此,CTGF作为TGF-β促纤维活性的下游信号介质,作用相对单一,它可能仅介导 TGF-β的部分生物学效应,即促进组织器官纤维化方面起重要作用.探讨其成为更加特异性药物靶位点的可能性更大,为以后具有组织特异性手段的基因治疗提供理论基础,成为防治肾脏纤维化领域新的热点.

本研究表明具有益气活血作用的中药复方制剂“通脉口服液”能明显下调 CTGFmRNA的表达,从基因水平抑制了 CTGF的表达,从而抑制了 CTGF介导的致纤维化生物学效应,起到防治肾小管间质纤维化的作用.

许多研究表明,TIF是由于基质蛋白合成增加和基质降解受抑制的综合结果.调节细胞外基质(ECM)降解的主要为基质金属蛋白酶系统(MMPs/TIMPs)和凝血纤溶系统(PA/PAI).其中 MMP-9又称明胶酶 B,主要降解明胶、Ⅳ、V、Ⅶ型胶原及层黏连蛋白、蛋白聚糖及弹性蛋白等,能降解完整的基底膜[9].MMP-9的抑制剂主要是 TIMP-1,文献显示 TIMP-1在多种表现为 ECM沉积的肾脏疾病中发挥作用[10-12].PA/PAI也是介导纤溶与抗纤溶平衡并参与调节 ECM的重要酶系,它不仅直接参与 ECM多种成分如 LN、FN的降解,而且是其他ECM降解系统的上游系统[13],还是 MMP激活剂之一,被激活的 MMP可以降解 ECM的胶原成分[14].

在许多肾脏疾病进展过程中,凝血纤溶系统异常会导致肾组织 ECM异常沉积和血栓微血管病变,引起肾小球硬化及肾小管间质纤维化.各种临床和实验研究已证实 PA/PAI-1在 TIF的发生中起着重要的作用,t-PA、u-PA水平的升高和活性增强对肾脏起着保护作用,而 PAI-1则相反[15-17].PA/PAI-1在 TIF病变中的显著变化,为其在 TIF发生发展过程中的作用提供了重要依据.可以预见,维持 PA/PAI-l之间的平衡、预防和治疗纤溶酶系统失调将为防止肾功能不全[18]、保护肾脏起到重要作用,也为临床防治 TIF寻找到了一个新的突破点.现已通过大量临床和实验研究发现,一些西药和中药及其有效成分的提取物可通过对 PA/AI-1的平衡起作用,来调节细胞外基质降解.

本研究结果表明,“通脉口服液”可下调肾小管间质 colIV的表达,并可上调 MMP-9的表达,下调TIMP-1的表达,提高 MMP-9/TIMP-1的比值,并能提高梗阻侧肾组织的 t-PA的含量,降低 PAI的含量,提高 t-PA/PAI的比值,同时能下调 CTGFmRNA的表达,进而通过细胞外基质降解系统(MMPs/TIMPs、PA/PAI)、CTGF的复杂调节取得抗肾小管间质纤维化的作用.

通脉口服液由黄芪、三七等成分组成,具有益气活血作用,为扶正驱邪的方剂.根据中医气血理论,“气能行血”,益气可促进活血.肾小管间质纤维化病变多存在凝血、纤溶系统的异常,存在肾内微循环的障碍,益气活血药可改善这一状态.且通过对“通脉口服液”的系列研究可以看出,通脉口服液可降低蛋白尿、改善患者的免疫功能、降低血脂、改善血液流变学指标,加上本次研究的结果,均证明了“通脉口服液”可以从不同的途径改善肾小管间质纤维化,进而延缓肾硬化,改善、稳定肾功能,同时也证明了中药复方多中心、多靶点的作用机理.

[1] EDDY A A.Molecular basisof renal fibrosis[J].Pediatr Nephrol,2000,15:290-301.

[2] 田金洲,王永炎,时 晶,等.证候模型研究的思路[J].北京中医药大学学报,2005,5:25-27.

[3] CHEVALIER R L,THOMHILL B A,CHANG A Y,et al.Recovery from release of ureteral obstruction in the rat:Relationship to nephrogenesis[J].Kidney Int.,2002,61(2):216-524.

[4] ZEISBERG M,MAESHIMA Y,MOSTERMAN B,et al.Renal fibrosis:extracellularmatrix m icro environment regulatesm igratory behavior of activated tubular epithelial cells[J].Am J Pathol,2002,160(6):2001-2008.

[5] BOTTINGER E P,BITZER M.TGF-bata signaling in renal disease[J].JAm Soc Nephrol,2002,13:2600-2610.

[6] BLOM I E,VANDIJK A J,WIETEN L,etal.In vitro evidence for differential involvement of CTGF,TGF-bata,and PDGF-BB in mesangial response to injury[J].Nephrol Dial Transplant,2001,16:l139-l148.

[7] LAN H Y.Tubular epithelial—myofbmblast transdiferentiation mechanisms in proximal tubule cells[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2003,12:25-29.

[8] 黄志文.细胞外基质降解酶系和肾间质纤维化[J].国外医学:泌尿系统分册,2004,24(3):416-419.

[9] BALBIN M,FUEYO A,KNAUPER V,et al.Collagenese 2(MMP-8)expression inmurine tissue remodeling processes,analysisof itspotential role in postpartum involution of the uterus[J].JBiol Chem,1998,273(37):315.

[10] EDDY A.Interstitial fibrosis in hypercholesterolem ic rats role of oxidation,matrix synthesis,and proteolytic cascades[J].Kidney Int,1998,53(5):1182.

[11] PANAGIOTIS M,KARAMESSINIS P M,ATHINA K.Proximal tubular epithelial cell integrins respond to high glucose by altered cell-matrix interactionsand differentially regulatematrixin expression[J].Laboratory Investigation,2002,82:1081.

[12] 王建中,陈香美,师镁柱,等.基质金属蛋白酶 -9和金属蛋白酶组织抑制物 -l在 IgA肾病肾组织中的表达[J].中华内科杂志,2002,41(2):75.

[13] 陈香美.凝血纤溶系统与细胞外基质调控系统在肾脏病中的作用[J].中华肾脏病杂志,2001,17(5):348-349.

[14] 陈高翔,屈燧林.纤溶酶原激活物抑制剂 -1与肾脏疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志,1999,8(4):155-157.

[15] 马 宏,王翠玲.肾病幼鼠尿激酶纤溶酶原激活物及其抑制物 mRNA与蛋白表达的特点和 ACEI干预的影响[J].中华儿科杂志,2002,40(5):292-295.

[16] LSHIDOYA S,OGATA Y,FUKUZAKIA,et al.Plasm inogen activator inhibitor-1 and tissue-type plasminogen activator are up—regulated during unilateral ureteral obstruction in adult rats[J].JUm1,2002,167(3):1503-1507.

[17] OGATA Y,LSHIDOYA S,FUKUZAKI A,et al.Upregulated expression of transforming growth factor—beta,type IV collagen,and plasminogen activator inhibitor-1mRNA are decreased after release of unilateral ureteral obstruction.J Exp Med,2002,197(3):159-168.

[18] 李文兰,赵 稷,王晓冬,等 .HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷、芍药苷的含量[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2008,24(1):12-15.