羽毛角蛋白降解的研究进展

王巍杰 程红燕 杨永强

动物的大量消费产生许多羽毛废弃物，传统处理方法主要为填埋、焚烧和产气，对环境造成很大危害。利用家禽羽毛制备动物饲料的研究较早，已经取得一定规模的应用发展，但羽毛中90%的角蛋白未被高效利用，造成可利用资源的浪费。角蛋白作为羽毛的主要成分，已经应用于化妆品行业，或作为复合材料、纤维制品的组分被利用。角蛋白因大量二硫键的交联成为复杂的三维网状结构，具有良好的稳定性和难溶性，一般方法很难将其水解，由此引发羽毛降解方法的研究热潮。目前常用途径有物理降解法、化学降解法和角蛋白酶降解法。尽管物理、化学方法研究较早，但存在破坏氨基酸结构、产物单一以及产物稳定性差等缺点。酶法反应条件温和，环境污染小，降解产物完整多样，具有应用前景。酶法降解涉及到产酶菌的筛选，酶的分离鉴定和羽毛降解等过程。

1 角蛋白结构及性质

角蛋白是中间丝超家族的重要成员，以α-螺旋和β-折叠进一步构成超螺旋多肽链，内部的半胱氨酸二硫键作为连接桥形成复杂的交联网。1930年，Aatbury和他的同事利用高角度的X射线衍射研究角蛋白的分子结构，提出蛋白质肽链是折叠的，随后发现这种折叠就是α-螺旋。他们将羊毛拉伸至原长2倍后发现，角蛋白变为β-折叠模式的装配。三维结构的分析显示，角蛋白二级结构主要为α-螺旋和β-折叠，β-折叠的形成和相互作用对于角蛋白的装配起着重要作用。根据二级结构的组成将角蛋白分为α-角蛋白和β-角蛋白。其中，α-角蛋白多见于脊椎动物上皮，富含大量半胱氨酸残基，二级结构则由大量α-螺旋构成，分子量为40～70 kDa。β-角蛋白分子量要小很多，在10～20 kDa范围，富含小侧链甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基，二级结构几乎都由β-折叠的片层结构组成，也是角蛋白稳定性高的重要原因。羽毛角蛋白主要为β-角蛋白，通过二硫键使各条肽链相互交联，具有良好的稳定性且不易被降解。

角蛋白强度与尼龙相当，其内部的交联网径要小于木材纤维。角蛋白的性质与其结构密切相关，它不被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶降解的原因是具有能抵抗特异性蛋白酶活性的长聚合链。角蛋白难溶和难降解的抗性不仅取决于聚合肽的超螺旋结构，还由于半胱氨酸形成的二硫键和其它分子相互作用使蛋白机械强度提高。角蛋白的反应活性位点是酰胺键、羧基和亚砜基等，当角蛋白浓度很低时，角蛋白分子倾向于形成分子内二硫键，使肽链不能通过分子间二硫键交联成网，这提示我们可通过控制角蛋白肽链的交联程度改变其难降解的性质。

2 羽毛降解生产角蛋白及类似物

2.1 物理方法

物理法也叫机械法，原理是利用特殊温度、压力条件使羽毛水解为可溶性多肽或寡肽混合物，高压蒸汽可增加角蛋白的溶解性。该法工艺流程简单，将羽毛除杂、投入反应器后通入蒸汽，得到块状蛋白产物后烘干粉碎便可作为动物饲料。近几年发现，微波法也可用于废弃羽毛的降解，较传统物理法有更高的产率，但产物单一，多为复合氨基酸，且研究尚处在实验室阶段。物理方法多会破坏氨基酸分子键，产物稳定性差，若作为动物饲料，得到的蛋白粉口味较差，消化率低，限制了物理法的应用范围。

2.2 化学方法

化学法利用酸、碱或氧化还原剂使羽毛中的角蛋白降解为可溶性蛋白、多肽或游离氨基酸。Kelly等利用Ca(OH)2处理鸡羽毛生产动物饲料，反应温度在150℃，羽毛角蛋白25 min内溶解80%，反应后经碳酸化可回收54%的钙剂。利用NaOH的碱水解法可产生多种不同肽链，增加酰胺键和亚砜含量能改变角蛋白的化学性质，碱溶液在65℃反应，2～5 h内可提出68%～82%的水溶性角蛋白，富含中间纤维和中间纤维丝成分，若将NaOH与Na2S联合溶解羽毛，40℃便能提取出角蛋白。氧化还原剂的使用也可降解羽毛，水、甘油和亚硫酸钠的组合可降解羽毛产生液体角蛋白，而巯基乙酸等物质的预处理可有效破坏二硫键。Schrooyen等选用2-巯基乙醇和尿素共同降解鸡羽毛，尿素起蛋白质溶胀作用，采用渗析除去巯基乙醇和尿素后发现，角蛋白多肽出现聚集现象，并且半胱氨酸残留物氧化形成凝胶，影响了角蛋白溶液的稳定性。改变实验条件发现在渗析前加入十二烷基硫酸钠（SDS）可阻止多肽链的聚集。但碱法效率不高，产物主要为多肽；酸法会腐蚀设备、污染环境，且复合氨基酸产率不高。酸碱的联合水解是今后的研究方向。

2.3 角蛋白酶降解法

角蛋白是一种不溶性蛋白，其良好的稳定性是因为半胱氨酸形成的大量二硫键使肽链相互交联，选择降解方法很关键。碱水解法或机械处理会破坏氨基酸内部结构，同时消耗大量能量。较好的选择是利用特异性蛋白酶将羽毛水解。角蛋白酶的应用十分广泛，可用作羽毛、毛发和胶原蛋白等物质的降解，具有高效的脱毛性；还可降解朊蛋白，用于洗涤剂和热处理工艺。角蛋白酶可从多种真菌和细菌的培养中得到，酶的来源日趋丰富。

2.3.1 产酶菌的筛选

角蛋白酶的活性取决于生产它的微生物，从芽孢杆菌(Bacillus sp)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和假单胞菌（Pseudomonas）等多种细菌或真菌都已分离出角蛋白酶，部分角蛋白酶只具有降解某些氨基酸的活性，比如在多种微生物中被分离的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。产酶菌的培养须有羽毛作为底物，将土壤样品与底物混合放至无菌培养皿中，在28℃下培养，并添加氯霉素抑制细菌生长，沙式琼脂或燕麦膳食琼脂的使用可用于产酶菌的纯化和鉴定。

在各种微生物中，尤以芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌分离出的角蛋白酶最多，发酵培养基组成成分得到了进一步优化，酶最适pH值为8温度为50℃，但酶活性会被EDTA显著抑制。最近，Kublanov等以100 mg/l蔗糖、200 mg/l酵母提取物、1 mg/l维生素、1 g/l蛋白胨和2 g/l猪毛为培养基培养一种少见嗜热厌氧菌，4 d后分离出分子量为150 kDa的罕见丝氨酸蛋白酶，并对酶水解活性进行了表征。

2.3.2 酶活性的鉴定

最初筛选的菌株合成酶可能只具有降解角蛋白部分组分的活性，需要对酶活性进行表征鉴定。先利用膜超滤，羟甲基纤维素，离子交换和葡聚糖凝胶层析等方法纯化角蛋白酶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。将角蛋白粉、硫酸盐缓冲液和培养滤液混合放至水浴摇床，各成分的配比因角蛋白酶种类的不同有所差异。反应一定时间后添加乙酸使反应终止。采用分光光度法，以仅缺少三氯乙酸的样品作为对照，每增长一单位吸收值代表一单位的酶活性。不同反应条件会影响酶活性，比如由弧菌分离出的角蛋白酶适宜在37℃反应，而产自金黄杆菌的蛋白酶在30℃、偏碱性条件下有最高的催化活性。此外，NaCl和十二烷基硫酸钠(SDS)等化学试剂的添加也会影响酶活性。

2.3.3 酶对羽毛的降解

酶对羽毛的降解既要考虑促进生产蛋白酶的产酶菌生长条件，也要考虑使角蛋白酶具有高催化活性的反应条件。Fakhfakh等将地衣芽孢杆菌RPK培养在含有7.5 g/l鸡羽毛，2 g/l的酵母提取物，0.5 g/l NaCl，0.1 g/l MgSO4·7H2O，0.7 g/l KH2PO4和 1.4 g/l K2HPO4的培养基中，37℃下搅拌48 h可使丝氨酸蛋白酶的产量和活性都达到较高水平。Cao等从一种嗜食单胞菌分离出具有羽毛降解活性的角蛋白酶，在pH值7.8和40℃条件下，羽毛得到最大程度的降解，酶的活性可完全被一种丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制，而金属离子又可提高酶活性。近几年固定化蛋白酶的利用较广泛，固定酶可最大限度减少酶的自溶，有利于产物蛋白质或多肽的分离，酶可以被重复利用。Lin等将角蛋白酶固定在孔径可调的玻璃微珠上，这种分离自地衣芽孢杆菌PWD-1的酶在酸性条件下显示出更好的热稳定性和耐受性，7 d后仍有40%的活性。

角蛋白酶的稳定性和活性受温度、pH值和化学底物影响。甲醇、乙醇和异丙醇等有机溶剂可诱导酶的活性，酶则表现出更高的催化效应，而EDTA抑制酶活性，加入5～10 mmol EDTA会导致30%的酶活性丧失。不同酶的反应速率也有所不同，从金黄杆菌分离出的角蛋白酶具有更快的降解速率。

3 角蛋白的综合应用

3.1 动物饲料

蛋白饲料的使用可促进动物生长，获得更好的饲喂效果，目前动物蛋白饲料有豆粕、鱼粉和肉粉等，这类饲料蛋白含量高，饲喂效果较好，但价格昂贵，部分需要进口，动物饲料资源的缺乏一定程度上制约着养殖业的发展。角蛋白被认为是一种优质蛋白饲料，对比实验证明，角蛋白混合物和玉米大豆粉有相似的促生长作用，其丰富的来源和低廉的成本有望解决饲料资源短缺的问题。

3.1.1 饲料制备

羽毛角蛋白饲料的制备经历了几个阶段，最早以家禽羽毛制成羽毛粉作为动物饲料，但受角蛋白不溶性的影响，其消化率仅为9.6%，远低于大豆蛋白99.5%的消化率，受限的饲喂效果影响了饲料的大规模应用。后来采用物理方法降解羽毛，利用高温膨化法对羽毛进行挤压，产物基本达到饲用要求，但需要在高温高压、长时间的特殊环境下操作，会对产物的内部结构造成破坏。随着羽毛降解研究的深入，角蛋白饲料的生产已从传统的高压水解、化学水解等过渡到生物技术处理羽毛制备饲料。

酶法制备是利用特异性角蛋白酶对羽毛进行降解，产物含有可溶性角蛋白、多肽和多种游离氨基酸，经分离纯化后制成高蛋白动物饲料，或与糠麸、糟渣等农副产品配合制成复合蛋白饲料。最近发现，角蛋白酶能提高饲料转化率，在每千克大豆粉和棉籽粉饲料中加入1 g角蛋白酶，可显著提高氮存留率和淀粉消化率。显微镜观察肉鸡小肠证实角蛋白酶能提高绒毛高度与隐窝深度比值，表明小肠消化吸收功能增强，酶和角蛋白有望不经分离用于动物饲料的制备。

3.1.2 饲料营养成分

饲料的营养成分直接影响动物对饲料的适口性，高效蛋白饲料应包含蛋白质、必需氨基酸、脂类和提供矿物质元素的盐类。蛋白质的供给使动物胴体脂肪减少，瘦肉率提高，赖氨酸可促进肌内脂肪和肌红蛋白合成，色氨酸具有改善肉质功效，钙离子参与的肌肉收缩能提高肉的鲜嫩度。饲料蛋白质营养价值常以氨基酸消化率评定，测定指标有粪表观消化率、回肠表观消化率（AID）和标准化回肠消化率（SID），饲料成分的搭配可参考美国NRC、英国ARC给出的动物营养需要和饲养标准。

角蛋白饲料营养搭配合理，膨化羽毛后粗蛋白含量在85%以上，使蛋白供应不会低于临界蛋白水平而使动物采食量减少。羽毛降解产物含有钙、磷等生长必需矿物质元素，可减少在饲料中人工添加盐类带来的环境污染。赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸作为主要限制性氨基酸影响动物生长代谢，必需氨基酸的平衡搭配是保证动物正常生长的重要因素，当配比失衡时动物甚至会选择不含蛋白的饲料进食。角蛋白饲料本身含有多种必需氨基酸，对比研究表明，羽毛酶解产物中赖氨酸和甲硫氨酸等氨基酸含量要显著高于NaOH的碱法降解产物，经简单的后加工流程制得回报率高的角蛋白饲料。

3.1.3 饲料的喂养

动物的日粮供应会影响生长发育，应根据其体重变化分为不同的饲养阶段。Noreen等用羽毛粉、豆粕和30%的玉米麸质饲喂重1.23 g的鱼苗，以占鱼苗湿重4%的饲料添加量进行6周实验，每天早上8点和下午2点分两次提供饲料。结果显示羽毛粉组鱼苗重量为（1.88±0.04）g，低于玉米麸质组的（2.07±0.01）g，可能是羽毛粉仅含45%的粗蛋白影响了饲喂效果。饲料的喂食状态会影响动物的适口性，粉状或微粒状的蛋白饲料与片状或块状饲料虽然消化率相似，但对动物自然采食量有不同影响。对于动物的饲养，可利用其屠宰、加工产生的大量下脚料和角蛋白饲料组成复合饲料，在节约成本的同时获得良好的饲喂效果。

3.1.4 饲料安全问题

目前饲料制备常添加抗菌药和生长促进剂以获得更好的饲喂效果，但对动物和人类健康带来安全隐患。饲料加工、运输过程中容易引起饲料霉变，黄曲霉等霉菌的产生会使动物中毒，很多饲料原料本身含有毒物质，棉籽饼粉中含有1%左右的有毒棉酚，饲喂未经脱毒的饼粉会引起动物中毒。角蛋白饲料不含抗营养因子，简化了原材料的预处理流程，饲料均衡的营养搭配可减少添加剂的掺入量，在加工运输中不易导致饲料霉变，具有更高的安全性，但在羽毛加工饲料前一定对羽毛进行高温预处理，旨在杀灭因羽毛收集过程中控制不严格混入的病死动物羽毛所携带的致病源。

3.2 医药行业

将羽毛角蛋白降解为可溶性蛋白质后，可利用蛋白质中氨基与其它高分子材料的基团相连接，构成角蛋白高分子聚合物。由于可溶性蛋白质的存在，聚合物具有优良的生物降解性能，可应用于医药制品、人工支架或高吸收材料的医用敷料制备。利用角蛋白制备的生物凝胶用于创伤相关的神经缺损修复，作用机制是通过激活雪旺氏细胞介导稳定高效的神经再生反应，扩大了角蛋白在医学方面的应用范围。

3.3 优良复合材料

角蛋白可作为纤维素角蛋白复合材料的组分，较一般纤维素材料有较小的吸附性，较高的吸湿性和较小的润湿角。角蛋白海绵适合作为良好支撑物用于细胞培养，和传统基于聚苯乙烯的细胞培养底物相比，这种支撑物更能改善细胞生长代谢水平。

3.4 食品行业

二硫键和氢键的交联赋予角蛋白很强的成膜能力，可作为外包膜用于食品包装。蛋白膜坚固、柔韧、无异味，可减少废弃包装材料对环境的危害，但需要加入一些增塑剂，如甘油、山梨醇等以提高蛋白膜的热学和力学等性能。

4 小结

角蛋白饲料的应用对于动物饲料供给具有重要意义，但角蛋白的难溶性会影响动物饲喂效果，需要降解羽毛得到水溶性角蛋白或多肽。目前，液体角蛋白的研究不够深入，不能满足大规模生产，制约工业化生产的瓶颈是有效的羽毛降解方法。物理法因其特殊的高温高压环境，会破坏肽链或氨基酸内部结构，降解产物的应用范围受到制约；化学法得到的降解产物稳定性较差，需进行化学修饰后才能被进一步利用。相较其它方法，酶法水解羽毛具有反应条件温和、产物特异性高和环境污染小等优点，降解产物更适合高蛋白饲料的制备。相信随着更多产酶菌的筛选会分离出适宜的角蛋白酶，降解获得性能优良的可溶性蛋白或多肽，更广泛地应用到饲料、复合材料、生物制品、医药等行业。

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