植物RNA病毒寄主因子基因的研究进展

熊 伟

(1.大理学院基础医学院,云南大理671000;2.广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530005)

植物RNA病毒寄主因子基因的研究进展

熊 伟1,2

(1.大理学院基础医学院,云南大理671000;2.广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530005)

文章综述了植物RNA病毒寄主因子基因的研究进展。

植物;RNA病毒;寄主因子基因

相对于寄主而言,病毒自身所携带的遗传信息是非常有限的,即使是最大的病毒,其基因组也仅仅能编码几百个基因,不足寄主编码基因的百分之一。病毒对寄主的成功侵染的绝大多数步骤都是在病毒与寄主因子的相互作用下进行的。基因极其贫乏的RNA病毒不仅需要寄主因子提供其存活所必须适应的基本环境,还需要寄主因子提供其可以直接利用的资源,寄主因子也因此在RNA病毒的侵染循环中扮演着重要的角色。对于植物RNA病毒,当其穿过细胞壁以及细胞膜进入细胞质后,便利用自身基因翻译的一些成分与寄主细胞中已存在的一些因子相互作用从而启动其自身RNA的复制,在细胞质中不停地增殖。现在认为,寄主因子(Host Factors)是寄主细胞在病毒侵染过程(包括病毒入侵、病毒基因表达、病毒粒子装配及释放等)中寄主提供给病毒的一切便利条件,寄主细胞内如果缺少这些寄主因子,病毒便不能复制或复制的效率大大降低[1]。

DNA病毒在寄主细胞内的表达可以利用寄主细胞的聚合酶,并受细胞内转录因子的调控。但对RNA病毒而言,其基因组的复制、转录过程中似乎较少依赖于植物细胞寄主因子的参与。因为真核生物内并不存在相应于RNA病毒复制的机制。曾经认为RNA病毒靠自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)即可完成其复制过程,支持这种观点的现象是在RNA病毒复制的早期,寄主细胞基因的正常的转录和翻译常常被打断。与此相悖的是RNA病毒明显携带更小的基因组,其复制过程应该更需要寄主因子的帮助。分离和纯化这些在RNA病毒复制时起作用的寄主因子对了解病毒与寄主的相互作用以及阐明RNA病毒复制的分子机制十分重要。例如当烟草花叶病毒TMV进入植物寄主细胞后,其基因组编码的复制酶便以正链ssRNA为模板合成负链RNA,再以负链RNA为模板合成正链RNA。单纯的183 kD的TMV复制酶并不能有效地起始TMV的复制,它需要与寄主因子相结合形成复制酶复合体并结合在宿主细胞的内质网或微管上[2];因此,鉴别RNA病毒寄主因子基因并阐明功能也就成了病毒与宿主相互作用领域非常重要的研究前沿。本文将在植物中已经发现的与RNA病毒复制有关的寄主因子基因综述如下。

1 TOM基因家族

在拟南芥—烟草花叶病毒系统已发现的与TMV复制酶相结合的寄主因子主要是拟南芥TOM基因家族,包括At TOM1,A t TOM2,At-TOM3三个基因,目前已经证实这三个基因与TMV基因组RNA的复制及亚基因组的mRNA合成相关。

1.1 A t TOM1基因

拟南芥A t TOM1基因是Ishikawa等[3]最早分离出来的,At TOM1基因突变株系用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导拟南芥的种子获得。接种病毒株TMV-Cg后,突变株PD114上TMV-Cg外壳蛋白的含量比野生型拟南芥的低。将TMV-Cg的RNA用电穿孔的方法导入PD114的原生质体,与野生型相比,检测到的TMV-Cg的正链RNA(包括基因组RNA和亚基因组mRNA)和外壳蛋白量相对减少。而亚基因组mRNA和外壳蛋白的减少趋于同步,说明只要存在mRNA,就可以以正常效率翻译得到外壳蛋白,因此,可以推测At TOM1编码的寄主因子作用的是病毒的基因组RNA在被侵染细胞中的有效复制。缺失TOM1基因虽能抑制TMV RNA的复制,但不影响拟南芥的正常生长发育。从拟南芥中克隆出的TOM1基因mRNA全长1369 bp(Genebank Accession No.AB016925),含一个长为876 bp的ORF,编码291个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质由几个高度疏水的区域组成。计算机模拟试验表明,它是一个六次或七次跨膜的蛋白,N末端位于膜外,在第28～31位氨基酸与168～171氨基酸处有N-糖基化位点。这种蛋白可以与TMV编码的解旋酶功能域相互作用,而TMV复制酶复合体与膜联合在一起,推测A t TOM1编码的跨膜蛋白作为膜的锚定物(membrane anchor)参与了复制酶复合体的形成[4]。

1.2 At TOM2基因

A t TOM2基因是Ohshima等[5]用快中子辐射的方法处理拟南芥的种子时,获得的抗TMV的拟南芥突变体。该突变体不同于用EMS处理的tom1突变体,它是由于另一位点TOM2基因发生突变。TOM2基因位于拟南芥1号染色体的中部区域,而TOM1基因位于拟南芥4号染色体的长臂。在TOM2基因发生突变的拟南芥原生质,接种TMV后,TMV RNA与CP的积累水平明显比野生型的积累水平低,表明TOM2基因的产物也是TMV高效复制所必需的。最近的研究证实tom2突变株涉及到寄主基因组核酸大约20kb的缺失,缺失区域包括A t TOM2A、A t-TOM2B两个基因,都与tom2突变株的表型有关。A t TOM2A编码一个280氨基酸的跨膜蛋白质,At TOM2B编码一个122氨基酸的基本蛋白质。A t TOM2A与A t TOM1连在一起相互作用定位到拟南芥的内质网膜上的,也是TMV复制复合体中的重要组成成分。

1.3 At TOM3基因

Yamanaka等[6]将TOM1基因突变的拟南芥突变体进行二次突变,结果使TMV的复制几乎完全被抑制。分析表明拟南芥的2号染色体上的一个位点TOM3基因发生了突变。TOM3基因全长cDNA ORF编码301个氨基酸,与TOM1有56%的同源性,含有高度疏水的区域,也是7次跨膜的蛋白。推测TOM3也是细胞质中膜结构相结合蛋白质,它与TMV的复制蛋白相结合而使TMV RNA定位在膜上,便于TMV的高效复制。TOM3基因在病毒复制过程中与TOM1基因起同等重要的作用。

TOM基因家族中的另一个成员是T H H1基因[7](TOM3 Homolog),它也与RNA病毒的复制有关。

2 帮助病毒在寄主细胞间移动的寄主基因

病毒在寄主细胞间的移动需要病毒编码的运动蛋白(movement protein,MP)以及寄主编码的因子的参与才能实现。在拟南芥中,芜菁脉明病毒(Turnip vein clearing virus,TVCV)在VSM1基因发生突变的植株中不能像在野生型植株那样能在整株中扩散。进一步研究发现,VSM1基因发生突变的植株能有效地阻断病毒从接种部位进入植物运输水分及养分的导管。但是VSM1基因发生突变的植株只能阻止烟草花叶病毒属的病毒进入导管,而不能阻止香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)的病毒进入植株的导管,意味着不同属的病毒需要不同的寄主因子的参与下才能进入导管从而扩散到植株的其他部位[8]。Matsushita等[9]在烟草中鉴定了一种转录激活子MBF1,它能与烟草运动蛋白相结合而调节烟草的基因表达使病毒能在细胞间长距离运输。在拟南芥中也分离出多种基因(CUM1,CUM2-1),其编码的产物与病毒运动蛋白相互作用而介导病毒在寄主细胞与细胞之间的运输。Chen等[10]利用蛋白质的相互作用从TMV感染的烟草中检测到一种烟草细胞壁中分子量约为38 kD的蛋白,并纯化了这种蛋白,鉴定为PME(Pectin Methylesterase)。它能与TMV MP的一定区域相结合而使TMV能在胞间扩散,如果MP缺失这一区域而不能与PME相结合,则TMV不能在胞间扩散。同样,如果细胞中没有PME,TMV也同样不能在胞间扩散。植物中这种基因能编码阻止或减缓这种运动的蛋白质,因此,它对病毒具有广谱抗性。另外,在用TEV筛选拟南芥突变株时,发现突变RTM1或RTM2,TEV就失去了在植株中系统移动的能力。

3 真核生物翻译启始因子3(eIF3)

大量的遗传及生物化学信息表明,寄主蛋白也是植物RNA病毒复制复合体的一部分,如TMV、BMV、黄瓜花叶病毒(CMV)、豇豆花叶病毒(CoMV)、红三叶死花叶病毒(RCNMV)和芜菁花叶病毒(TYMV)等多种病毒的RdRp至少与一种寄主蛋白共纯化。然而,绝大多数寄主蛋白本身的性质及其在病毒复制过程中的作用还不甚清楚。不过,有实验数据表明,真核生物翻译启始因子3(eukaryotic translation initiation factor 3,eIF3)在TMV、BMV的复制过程中起到重要的作用。

Osman等[11]和Wahanabe等[12]发现从被侵染的马铃薯叶片中分离到的TMV RdRp包含几种寄主蛋白,其中有一种56 kD的蛋白与酵母的eIF3中的GCD10亚基存在血清学相关性。GCD10蛋白的抗体可抑制RdRp作用下的TMV基因组RNA及双链RNA的合成;如果预先加入纯化的GCD10蛋白,则GCD10蛋白的抗体不降低TMV基因组RNA及双链RNA的合成效率,表明这种类似GCD10亚基的蛋白与TMV的复制有关。在酵母双杂交系统中,酵母eIF3的GCD10亚基与TMV的126/183 kD复制酶蛋白的甲基转移酶功能域进行选择性相互作用,进一步证实了GCD10亚基参与TMV RNA复制这一结论[13]。

从被侵染的大麦中提取的BMV RNA聚合酶包含一种大麦蛋白,这种大麦蛋白与小麦胚eIF3 41kD基因存在血清学关系,与BMV的2a蛋白有高度的亲和力和专化性,而且加入小麦胚eIF3或来自小麦胚的41 kD亚基时,RdRp能在体外特异性合成BMV的负链RNA,复制能力提高3倍。在活体内,与eIF3 41kD亚基同源的蛋白与BMV的RdRp结合在一起,并参与BMV RNA的复制[14]。与BMV RdRp结合的45 kD大麦蛋白和TMV复制酶复合体的56 kD马铃薯蛋白分别与eIF3不同的亚基相对应,说明这两种寄主蛋白之间无同源关系,并在各自病毒的复制过程中起不同的作用。

4 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因(SA H H)

SA H H基因通过调节细胞的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)与S-腺苷甲硫氨酸的比例来控制生物的甲基化反应。DNA与蛋白质的甲基化与去甲基化在许多生物的信号传导中扮演着十分重要的作用。另外,SAHH也可能通过调节SAH/SAM的比例来控制mRNA 5’端帽子的甲基化。抑制细胞内SAHH的活性可能会降低宿主mRNA或病毒mRNA 5’端甲基化帽子的甲基化程度。实际上,SAHH是一种很有效的抗动物病毒的抑制剂,也能抑制植物病毒的复制[15]。Chikara等[16]将SA H H基因反义转入烟草中,获得部分抗TMV的植株,TMV在转基因烟草中的局部坏死斑更少更小,对其他烟草也能推迟系统感染的时间。同时,转SA H H的部分烟草也能抗CMV与PVX。接种CMV后,产生系统性感染的时间明显推迟,接种PVX 2个月后,都未能有可见症状,说明利用反义抑制SAHH基因能提高植物的抗病毒能力。但转SAHH基因的烟草有一半表现生长改变,甚至有的出现生长轻微矮化。SA H HcDNA为1818 bp(GeneBank Accession No.D45204),编码产生由485个氨基酸组成的蛋白质。

5 真核生物延长因子1A基因(eEF1A)

TMV的RNA基因的3’端缺少Poly(A)的结构,而具有类tRNA结构。此类tRNA结构对TMV RNA的翻译复制具有重要的作用,它能与宿主延长因子1A(eEF1A)相结合而启动TMV RNA负链的合成,提高TMV RNA的复制效率[17],如果能降低寄主细胞内的延长因子1A基因的表达水平就有可能抑制TMV的复制。通过转入外源的延长因子1A基因来沉默内源的延长因子1A基因,从而获得抗TMV的植株。

6 其他已发现的与病毒复制有关的植物寄主因子

除了上述已介绍的一些植物寄主因子外,发现芜菁黄花叶病毒的复制与寄主EF-1α、elF3和Tubulin有关[18],这些寄主因子基因是否能用于构建抗病毒植物仍需进一步研究。

7 问题与展望

自从1986年Powell等将TMV的外壳蛋白基因导入烟草,获得第一例抗病毒转基因烟草以来,又有许多抗病毒基因工程策略应用于植物,成为防治植物病毒病的主要方法。一种方法是将来源于病毒自身的基因或基因的调控序列导入受体植物,从而获得病毒起源抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株,但是利用这种方法得到的抗病毒植株一般表现为垂直抗病性,而且,将来源于病毒的基因转入植物而使植物获得抗病毒的能力这一方法存在潜在的危险因素;另一种方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)来获得抗病毒植物。

研究植物RNA病毒的寄主因子能进一步揭示RNA病毒复制的分子机制,同时为提出新的抗病毒策略提供理论依据。如At TOM1和At-TOM3等基因突变后,突变株在常规的栽培管理条件下正常生长,而烟草花叶病毒(TMV)复制受抑制,使得通过诱变寄主因子基因获得抗病毒(或耐病毒)植株成为可能;另有研究发现,黄瓜花叶病毒(CMV)在拟南芥细胞间转移,必须依赖于CUM1及CUM2基因[19]。对寄主因子的研究为抗病毒基因工程提供了一条新的途径,即将寄主细胞中支持RNA病毒复制的基因敲除或沉默,使其提供不了病毒复制所需的条件,从而达到获得广谱性抗病毒植株的目的。相信随着实验技术的不断发展与成熟,不久的将来会有越来越多的植物RNA病毒寄主因子基因被发现,利用基因沉默技术抑制寄主因子基因能培育出大量新型的抗病毒种质。

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Abstract:This paper reviews the research advances of RNA virus host factor gene in plant.

Key Words:plant;RNA virus;host factor gene

The Research Advances of RNA Virus Host Factor Gene in Plant

Xiong Wei1,2
(1.College of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan671000,China;2.College of Lif e Science and Technology,Guangxi University,N anning,Guangxi530005,China)

Q75;S432.4+1

A

1671-2544(2010)03-0015-05

2010-02-19

熊 伟(1982— ),男,湖南株洲人,大理学院基础医学院讲师,云南大学生命科学学院博士研究生。

(责任编辑:陈锦华)