猪分子育种研究进展

刘 榜

（华中农业大学动物科技学院动物分子生物学与育种实验室，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北 武汉 430070）

分子育种主要是一种利用DNA 水平上的分子标记对生物群体进行遗传改良。动物分子育种方法主要包括标记辅助育种、转基因育种和体细胞克隆育种。本文主要从标记辅助育种和转基因育种两个方面综述猪分子育种的研究进展。

1 标记辅助育种

标记辅助育种是利用DNA 水平上的分子标记进行猪的遗传改良，现阶段DNA 标记辅助育种技术仅仅是一种辅助手段，还必须与常规育种技术特别是数量遗传学方法相结合，故称之为标记“辅助”育种。标记辅助育种中DNA标记的鉴定是基础，目前虽然有大量的猪经济性状候选基因多态性以及关联分析结果，但真正已经鉴定的QTN 却甚少。QTN 鉴定需要利用大规模的资源群体和基因组信息，现对猪基因组研究进展、可以利用的QTN 及标记辅助选择方法进行介绍。

1.1 猪基因组计划研究进展

猪基因组研究已经从单个基因的克隆和功能研究发展到对整个基因组的研究。中国科学院北京基因组研究所(Beijing Genomic Institute)与丹麦动物科学研究所(Danish Institute of Animal Science)、皇家兽医与农业大学(the Roya l Veterinary and Agriculture University(KVL))、丹麦养猪业的代表共同于2000 年10 月20 日签署猪基因组测序计划协议。至2005 年，该计划完成了380 万个鸟枪法测序反应结果，覆盖了0.66 个基因组（Wernersson,R 等，2005），并建立了97 个非标准化的cDNA 文库，提供了大约100 万条EST 序列（Gorodkin,J.等，2007）。在继2004 年先后完成了鸡和牛的基因组测序后，美国农业部(USDA)展开了猪基因组研究计划，2006 年获得了USDA 首批1000 万美元的基金支持，正式在Sanger 基因组测序中心开始以杜洛克猪为材料的基因组测序工作。到2009 年10 月2 号，已完成了猪98%的基因组草图，所有序列都已经释放，可以通过Preensemble(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)获得。

1.2 已经应用于标记辅助育种的QTN

QTN 是指通过改变某个特定核苷酸，能够使个体的表型从一种转变到另外一种（Glazier,2002）。可以说QTN 是性状产生变异的基础，是QTL 对表型影响的根本原因。目前，在猪中已经鉴定出3 个与肌肉发育和日增重相关的QTN 和1个可能的影响肌肉生长的QTN，他们分别是兰尼定1 型受体基因（ryanodine receptor 1,RYR1）、胰岛素样生长因子2型基因（insulin-like growth factor 2,IGF2）、黑皮质素受体4（melanocortin receptor 4,MC4R）基因和肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因。

RYR1 参与了猪肌肉生长发育过程，与骨骼肌肌质网中主要钙离子释放通道。在该基因1843bp 位置发生的一个CT突变，导致编码蛋白在这个位置从精氨酸到半胱氨酸的改变（Fujii J 等，1991）。在不同的猪品种中，这个碱基的改变与瘦肉率和体重呈显著相关。2003 年，与猪肌肉发育相关的第二个QTN 在印记表达的IGF2 基因中发现（Van Laere A等，2003），在IGF2 的第三内含子中的一个进化保守的CpG岛区域，3072 位置的GA 突变导致了该基因表达量升高三倍，并增加了猪的肌肉生长速度和心脏体积与减少了脂肪的沉积。MC4R 是一个G 蛋白偶联受体，参与了一个与采食量和能量平衡的重要通路。Kim KS,等（2000）在MC4R中发现893 位GA 错义突变导致了其编码的天冬氨酸改变成天冬酰胺，这个变异被证实是影响背膘厚、日增重的QTN。第4 个可能的QTN 是MSTN 启动子中的447 位AG 突变，Stinckens A 等（2008）发现该突变导致了肌细胞增强子3（MEF3）的结合位点的丢失，并发现发生突变的四周龄仔猪比野生型的MSTN 基因的表达水平低，推测该位点可能是影响肌肉生长的QTN。上述4 个QTN 对猪日增重与肌肉生长性状有较大影响，均可作为标记在选种中应用。但在应用的过程中应考虑他们之间的相互作用，有关4 个基因间的互作Stinckens,A 等（2009）在长白猪和大白猪中发现了他们之间的关系。

1.3 标记辅助选择方法

标记辅助选择（Marker Assisted Selection,MAS）是通过寻找对动物特定性状有较大影响的数量性状位点（Quantitative Trait Loci,QTL）附近的分子标记，并 通过判断标记的基因型对种畜进行选择的方法。利用MAS可以做出早期选种，缩短世代间隔，提高选择的准确性、提高选择强度，降低育种成本，加快遗传进展，特别对于遗传力低的性状、晚期表现性状，以及活体难于度量的性状更具有价值。目前，依据选择标记与性状控制位点的关系，MAS 可分为标记距离较远的连锁平衡（Linkage Equilibrium,LE）MAS（LE-MAS），标记距离较近的连锁不平衡（Linkage Disequilibrium,LD）MAS（LD-MAS），以及标记本身即为causal 位点的基因辅助选择（Gene Assisted Selection,GAS）。这三种方法都已经在动物育种上进行了应用。此外，最近还出现了一种全基因组选择的方法，预计将是未来标记辅助选择发展的重要方向之一，但目前因为检测成本过高暂时还不能大面积推广使用，同时全基因组选择亦还有部分理论和方法问题尚未完全解决。

1.3.1 连锁平衡MAS

连锁平衡MAS 使用的是连锁平衡标记（LE 标记），LE标记都是在一些对性状有较大影响的QTL 区域附近，是一类与QTL 连锁的标记。由于LE 标记相对LD 标记和直接标记，它与形成QTL 中的致因突变位点相隔还较远，只是与QTL 有一定程度的连锁，选择效果不能保证，特别是不能保证所有家系中都存在这种连锁关系。所以，在实施选种中，不能跨越家系去使用LE 标记，这限制了连锁平衡MAS 的使用范围。

1.3.2 连锁不平衡MAS

连锁不平衡MAS 使用的是连锁不平衡标记（LD 标记），这类标记主要是通过精细定位或者候选基因的方法得到的（Rothschild and Soller,1997）。由于LD 标记与对性状影响的功能突变位点紧密连锁，所以选择的有效性大大地提高，而且通常能在不同的家系中应用连锁不平衡MAS 进行选种。对现阶段而言，LD 标记应是分子育种使用的主要标记类型。

1.3.3 基因辅助选择

基因辅助选择使用的是直接标记，这种标记直接来自对性状有较大影响的QTN。由于这种标记直接来源于影响性状的基因的功能突变位点，所以能够用于不同情形，包括不同家系的辅助选择。但是，目前已经在猪中鉴定的QTN 数量甚少，实际能用于基因辅助选择的标记并不多。

1.3.4 全基因组选择

由于多个物种的测序完成和SNP 芯片的出现，一种新的选择方法——全基因组选择在2001 年被提出（Meuwissen，2001）。全基因组选择是指使用覆盖全基因组上的标记来进行选择，与之前的MAS 相比，不依赖于对性状影响较大的标记的数目，并能对多个性状进行同时选择，提高了选择的准确性。通常，全基因组选择的方法有两步，首先是通过对资源群体进行全基因组的SNP 芯片扫描和各个性状表性值的测定统计，估计出基因组不同组分对目标性状的影响程度，并构建出育种值的预测模型；然后根据育种群体中多SNP、单倍型、单倍型域、染色体区段等综合构成的全基因组基因型信息进行估计，得到个体的基因组估计育种值（Genome EBV,GEBV），然后依据GEBV 进行选种。由于全基因组选择利用的信息量最大，选择的准确性将极大地提升，这将是今后家畜分子育种的主要发展方向。

2 转基因育种

转基因育种是指通过转基因的方法，将外源的基因（包括种内和种间）整合到猪的基因组中或者将猪自身的基因敲除或沉默，借此来定向改变猪的性状，以转基因材料进行的育种。转基因技术作为育种技术的优点在于：不但可以打破物种界限导入其他物种的优良基因，也可以通过对物种内现有基因组的“精细手术”，获得依靠自然选择与人工选择无法新基因组合。目前，转基因技术主要用作生物工程手段，作为分子育种技术尚处于探索阶段。但随着国家转基因重大专项的实施，转基因技术将会成为家畜分子育种的重要内容。

转基因技术已成功运用于猪，获得了一些转基因猪。1985 年，Hammer 等通过显微注射的方法，将由小鼠MT-1启动子驱动的人生长激素基因（hGH）注射到猪、羊和兔卵细胞的原核中，该融合基因成功地整合到了猪和兔的基因组上并能正常表达；1991 年，Shamay 利用同样的方法，将小鼠乳清酸性蛋白基因（mWAP）转入到猪，mWAP 基因在猪的乳腺中成功表达；1992 年，Swanson 等成功获得了能生产人血红蛋白的转基因猪，Muller 等将小鼠的MX1 基因转入猪体内，试图生产抵抗流感病毒的转基因猪；1995 年，Rosengard 等将人的补体抑制因子和衰退加速因子(hDAF)转移至猪胚中，有27 头转基因猪的hDAF 在其内皮细胞、血管平滑肌和鳞状上皮细胞等细胞中有不同程度的表达；2001 年，加拿大Guelph 大学Golovan 等人通过显微注射原核胚的方法，培育出转植酸酶的转基因环保型猪，使得粪便中磷的排放量减少了75%；2003 年，Ramsoondar 等将α(1,3)半乳糖苷转移酶基因敲除的猪，试图解决器官移植时的免疫排斥反应；2004 年，日本克隆出体内含有水母基因的转基因猪；2006 年，Lai 等奖秀丽线虫的编码ω-3 脂肪酸去饱和酶（FAT-1）基因克隆到猪中，显著地提高了组织中不饱和脂肪酸的含量。

我国的转基因猪也已取得了重要成果：1989 年，中国农业大学陈永福与湖北省农科院生物技术研究所合作，将猪生长激素基因（GH）转入湖北白猪中，显著提高了生长速度与饲料利用率；湖北省畜牧所与中国农科院兰州兽医所合作，将抗猪瘟病毒（HCV）基因导入猪中，获得了抗猪瘟的转基因猪（郑新民、魏庆信等，1998）；2000 年，郑新民、魏庆信等用显微注射的方法，生产出来能够合成人血清蛋白（HAS）的转基因猪；2006 年底，东北农业大学刘忠华教授带领的团队研制出中国首只转基因“荧光猪”；2008 年，中国农科院北京畜牧兽医研究所李奎教授等人，继美国之后培育出了转FAT-1 基因的保健猪。这些转基因材料一旦经过生物安全评价就可以作为育种素材进行新品种的培育。目前，我国转基因生物新品种重大专项的启动将进一步推动转基因猪的研究进程。