遗传标记在四川黑山羊研究中的应用

2010-08-15陈明华

中国草食动物科学 2010年5期

陈明华

（攀枝花市农林科学研究院畜牧水产研究所，四川 617061）

遗传标记包括形态学标记（morphological marker）、细胞学标记（cytological marker）、生物化学标记（biochemical marker）、免疫学标记（immune genetic markers）和分子标记（molecular marker）5种类型。自从19世纪中期，奥地利学者孟德尔首创了将形态学性状作为遗传标记的应用先例以来，遗传标记得到发展和丰富。形态学标记、细胞学标记、生化标记、免疫学标记等一直被广泛应用，然而这些标记仅是遗传物质的间接反映，都无法直接反映遗传物质的特征，且易受环境的影响，因此具有很大的局限性。DNA分子标记直接反映DNA水平上的遗传变异，能稳定遗传、信息量大、可靠性高、消除了环境影响，可以反映生物的群体和个体特征。随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子克隆及DNA重组技术的日趋完善，DNA水平的遗传标记得到广泛应用。本文就生物化学标记和分子标记在四川黑山羊中的应用作一综述。

1 生物化学标记

生化遗传标记是随着各种电泳技术的发展而兴起的一种遗传标记，以动物体内的某些生化性状为遗传标记，如血型、血清蛋白及同工酶。蛋白电泳所检测的主要是血浆和血细胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的变化，通过对一系列蛋白和同工酶的检测，就可为动物品种内的遗传变异和品种间的亲缘关系提供有用的信息。因蛋白电泳技术操作简便、快速及检测费用相对较低，且多态性比形态学标记和细胞遗传标记丰富。已被广泛应用于物种起源与分类研究和动物育种中。

余雪梅等［1］检测了建昌黑山羊血清白蛋白（AIb）、运铁蛋白（Tf）和酯酶（Es）3个基因座的多态性。结果表明，建昌黑山羊、台湾本地山羊、西德有色山羊3个品种山羊遗传距离均超过0.1，它们都是独立的品种。江明锋等［2］分析山谷型藏山羊、建昌黑山羊、安哥拉山羊乳中的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg、SA 等基因座，结果表明，3个品种的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg有多态，SA 无多态。其中乳LDH有A、B、C三种表型。As-CN有AA、AB、BB三种表型。β-CN和β-lg多为杂合的AB型，其它的电泳表型极少。乳SA为单态，定为AA型。王杰等［3］采用PAGE法检测安哥拉山羊改良建昌黑山羊杂交后代F3的 Hb、Tf、Hp、Pr、Alb、Po、LDH、Akp 和 Amy 等基因座的多态性，结果表明，F3的 Hb、Tf、Hp、Akp 呈多态，Alb、Pr、Po、LDH、Amy呈单态；LDH 同工酶相对活力顺序为LDH1＞LDH3＞LDH2 ＞LDH4＞LDH5；F3与安哥拉山羊Akp基因型分布差异显著（P＜0.05），与建昌黑山羊差异极显著（P＜0.01）；LDH1的相对活力与净毛率呈极显著负相关（P＜0.01），LDH5与两型毛根数百分比呈显著正相关（P＜0.05）、与两型毛重量百分比呈极显著正相关（P＜0.01）、与无髓毛伸度呈极显著负相关（P＜0.01），LDH其他各条带的相对活力与产毛性状无显著相关。汤守富等［4］研究了金堂黑山羊血液运铁蛋白（Tf）、后白蛋白（Pa）及白蛋白（Alb）3个基因座的遗传多态性。结果表明：金堂黑山羊群体中Tf和Pa两个基因座均表现出多态性，Alb基因座呈单态；Tf和Pa两个基因座基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律。潘爱銮等［5］研究了安哥拉山羊和建昌黑山羊及其高代杂种羊（F3）9个血液蛋白基因座的遗传多态性。结果表明：建昌黑山羊血液 Alb、Pr、Pa、Tf、Hp、Hb、LDH、Amy 呈单态，Akp 呈多态。建昌黑山羊的平均基因杂合度与一致度分别为0.062 1和0.937 9。彭先文等［6］研究了建昌黑山羊等5个品种山羊及其部分杂一代的乳MUC1生化遗传特性。结果表明：山羊乳MUC1呈现出多态性，基因型与山羊品种有关，建昌黑山羊有3种基因型，基因杂合度为0.495 0。郑玉才等［7］研究了金堂黑山羊、巴普山羊等四川5个地方山羊品种及波尔山羊乳上皮黏蛋白MUC1的遗传多态性。结果显示，山羊乳MUC1表现出丰富的多态性；MUC1的等位基因、基因型及其分布存在品种间差异；山羊乳MUC1基因杂合度较大，遗传变异程度高；根据乳MUC1等位基因频率对6个山羊品种进行了聚类分析，能较好地反映各品种间的亲缘关系。王杰等［8］分析成都麻羊和四川9个黑山羊品种（群体）酪蛋白多态性。结果表明，在供试山羊品种（群体）中β-CN呈单态，带型为 β-CN （AB）；α-CN 均呈现 αs1-CN（H）、αs1-CN（L）、αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）型，在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，还存在αs2-CN（DD）型。在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）的乳脂含量显著高于αs2-CN（DD）的乳脂含量（P＜0.05）。

2 分子标记

由于分子生物学技术的飞速发展，重组技术DNA的完善及PCR技术和新电泳技术的出现，涌现出了大量的分子遗传标记。与其他几种遗传标记相比，DNA分子标记具有大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速等优越性。DNA分子标记技术已广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

2.1 随机扩增多态DNA

随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD），扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的多态性。这种多态性具有个体特异性，与RFLP等其他分子标记相比，RAPD具有DNA用量少、不需特殊的探针、灵敏度高、操作简便、经济快速等优点，现已广泛应用于动植物遗传作图、基因快速定位、特殊染色体片段的鉴定和分离、性别鉴定以及群体遗传变异的检测。

钟红梅等［9］采用RAPD方法对藏山羊、安哥拉山羊、建昌黑山羊的巴普类群3个山羊品种（类群）的基因组DNA进行多态性和亲缘关系研究，结果表明：3个山羊品种（类群）间的多态性大于品种（类群）内的多态性，藏山羊与安哥拉山羊之间亲缘关系较近，巴普类群与安哥拉山羊之间亲缘关系较远。王杰等［10］对四川9个黑山羊品种（群体）进行RAPD标记研究。结果表明，引物OPQ-06未在乐至黑山羊中扩增出900 bp DNA片段，而在其他8个黑山羊品种（群体）中出现率均为1，可作为区分乐至黑山羊和其他8个黑山羊品种（群体）的分子遗传标记。引物OPK-03未在江安黑山羊扩增出550bp DNA片段，在其他8个黑山羊品种（群体）中出现率均为1，可用于区分江安黑山羊和其他8个黑山羊品种（群体）的分子遗传标记。李力等［11］在黑山羊群体中共筛选到5个分子标记分别与不同性状相关，其遗传基础可能是该标记与控制性状的QTL或主基因连锁。朱金秋等［12］对四川黑山羊、南江黄羊、北川白山羊、成都麻羊4个山羊品种和藏绵羊进行RAPD分析。结果表明：黑山羊与南江黄羊的遗传距离最小，亲缘关系较近。

2.2 DNA指纹

以克隆或人工合成的探针进行RFLP分析，可同时检测到许多高变区，产生相应谱带，DNA指纹（DNA fingerprinting）图具有高度变异性、个体专一性和组织稳定性，是一项非常有价值的技术。另外，以微卫星为基础的寡核苷酸DNA指纹技术近年来也倍受研究者欢迎。DNA指纹技术可用于群体亲缘关系、杂种优势预测、基因定位、标记辅助选择等方面。

晏兆莉［13］以人工合成的寡核苷酸（CAC）5/（GTG）5为探针，HaeⅢ酶切，采用地高辛（digitoxin）标记及检测技术，构建山谷型藏山羊、安哥拉山羊及其杂种羊的DNA指纹图谱。分析表明，山谷型藏山羊群体内遗传差异大，而安哥拉山羊遗传差异小，杂种羊群体内遗传差异小于其母本山谷型藏山羊。在供试群体内，两个无关个体具有相同 DNA 指纹的概率为 1.1×10－5～1.9×10－11，系本谱带遗传给后代的概率符合0.5的预期值。王杰等［14］应用寡苷酸探针（CA/GATA/TCC）5检测安哥拉山羊和安哥拉山羊级进杂交F2、F3的DNA指纹图谱。结果表明，供试羊只个体平均检出18.2±0.4条谱带；在安哥拉山羊及其 F2、F3中，探针的鉴别机率分别为 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；群体内DNA指纹平均相似系数安哥拉山羊及其F2、F3分别为0.453 9、0.407 7和 0.611 1；在安哥拉山羊DNA指纹图谱中，发现2.3kb和8.6kb谱带为特异性谱带。王杰等［15］研究安哥拉山羊和建昌黑山羊及安哥拉山羊与建昌黑山羊级进杂交的F2、F3的DNA指纹图谱。结果表明，安哥拉山羊、F2、F3的鉴别机率分别为 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；亲子鉴定的父权概率W=0.988 9。王杰等［16］研究四川9个黑山羊品种（群体）的DNA指纹图谱，结果表明，在供试黑山羊中，未发现有共同的谱带和性别特异谱带。9.0 kb和2.2 kb为建昌黑山羊共有谱带，9.0 kb为金堂黑山羊共有谱带，9.0kb、6.2kb和5.5 kb为白玉黑山羊共有谱带，其余各黑山羊品种（群体）内无共有谱带。

2.3 随机片段长度多态

随机片段长度多态AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。重复性强、可信度高、多态性强、分辨率高，不需要Southern杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组DNA的序列信息，样品适用性广、遗传性稳定，在遗传育种研究、基因组研究中有着广泛的应用前景。

王杰等［17］采用AFLP标记研究成都麻羊与8个黑山羊品种（群体）的遗传多样性。结果表明，供试8个山羊品种（群体）的遗传多样性指数在0.088 8～0.228 9之间，其中营山黑山羊的遗传多样性指数最大，白玉黑山羊最小，其余山羊品种（群体）介于其间。

2.4 微卫星DNA

微卫星DNA（microsatellite DNA）是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中，具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析等优点。已广泛用于构建物种的遗传连锁图谱、基因鉴定、物种演化和群体间遗传分化研究等。

王杰等［18］对四川9个黑山羊品种（群体）进行微卫星DNA遗传多态性研究，结果表明，10个微卫星座位在9个黑山羊品种（群体）中均为高度多态座位。嘉陵与营山黑山羊聚为一类；自贡与江安黑山羊聚在一起后，再与合江黑山羊聚为一类；金堂与乐至黑山羊聚为一类；白玉与建昌黑山羊聚为一类。最后4种聚为一大类。陈明华等［19］对四川9个黑山羊品种（群体）进行X染色体微卫星DNA遗传多态性研究，结果表明，7个微卫星座位在9个黑山羊品种（群体）中均为高度多态座位，聚类结果与王杰等（2006）的结果一致。

2.5 线粒体DNA

造成线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）多态性的原因主要是碱基取代、长度变化和序列重排，因而可以利用限制性酶切技术直接检测mtDNA的多态性。mtDNA以其分子量小、进化速度快（为单拷贝基因的5～10倍）、遗传上具有自主性和严格的母系遗传等特性而被广泛应用于分子进化、亲缘关系、畜群遗传结构、杂种优势预测和地方品种资源考察。

李祥龙等［20］研究了建昌黑山羊等来自国内18个地方山羊品种mtDNA的RFLP，研究结果提示我国地方山羊品种起源于两种不同的母系祖先；我国地方山羊品种mtDNA遗传多样性比较贫乏，分化程度较低。王杰等［21］对成都麻羊与四川各地黑山羊品种（群体）mtDNA D-1oop序列多态性进行分析。共检测到l0种单倍型，群体间共有多态座位83个，单一多态座位23个，简约信息座位24个，平均核苷酸歧异度为0.001 510，D-loop序列多态性较贫乏。10个品种（群体）分为两大类，合江黑山羊与江安黑山羊先聚在一起后，再与自贡黑山羊聚为一类，营山黑山羊与嘉陵黑山羊聚为一类，两类形成一大类；成都麻羊先与金堂黑山羊聚在一起后，再依次与乐至黑山羊、建昌黑山羊、白玉黑山羊形成另一大类，最后两个大类聚在一起。聚类结果与品种（群体）来源和生态地理分布相一致。

3 展望

四川省的黑山羊资源十分丰富，约有1 300万只，遍布全省绝大部分地区。主要有建昌黑山羊、金堂黑山羊、乐至黑山羊、自贡黑山羊、合江黑山羊、江安黑山羊、白玉黑山羊、营山黑山羊、嘉陵黑山羊、美姑黑山羊等。近年来，为了促进地方经济发展，先后命名了金堂黑山羊、乐至黑山羊、自贡黑山羊等地方品种。

除了从形态特征和生产性能鉴别分布在不同地区的黑山羊品种（群体）间的差异外，由于历史和地域等原因，各个品种（群体）间的遗传关系不是很清楚。虽然一些研究者［10，16-19，21］从分子水平研究这些黑山羊品种（群体）的遗传多样性，但是，为了对四川黑山羊品种（群体）进一步选育提高以及品种资源的合理保护和开发利用还需要更系统、更全面地从分子水平研究这些黑山羊品种（群体）的遗传多样性，了解这些黑山羊品种（群体）的进化历史、分类地位和相互关系，从分子水平界定其是品种、不同生态类型还是杂交群体。

由于具有其他标记无可比拟的优点，分子遗传标记在四川黑山羊群体遗传变异研究、基因定位研究、群体亲缘关系以及标记辅助选择研究等方面有着广阔的应用前景。

［1］余雪梅，张学舜.建昌黑山羊血液蛋白多态性的研究［J］.西南民族学院学报：自然科学版，1990（1）：53-57.

［2］江明锋，王杰，郑玉才，等.山谷型藏山羊建昌黑山羊安哥拉山羊乳生化遗传标记研究［J］.西南民族学院学报：自然科学版，1998（2）：190-195.

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［4］汤守富，王春秀，刘期华.金堂黑山羊血液蛋白遗传多态性的研究［J］.西南民族学院学报：自然科学版，2001，27（4）：451-454.

［5］潘爱銮，王杰，彭先文.三个山羊群体血液蛋白多态性研究［J］.中国畜牧杂志，2002，38（3）：12-14.

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