口蹄疫疫苗研究新进展

刘佑东（广西柳州畜牧兽医学校，柳州 545003）

口蹄疫（food and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（food and mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病［1］。由于FMD暴发引起幼小动物死亡、成年动物生产能力降低，并由此而导致疫区畜产品禁运，造成重大经济损失。因此该病被国际兽医局（OIE）列为第一位A类烈性传染病。目前，FMD呈全世界范围流行趋势。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型（云南保山型）。接种疫苗是特异性预防口蹄疫的有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件，在口蹄疫的防控中，最早使用的疫苗是灭活苗，长期以来，灭活苗在口蹄疫的防控中发挥了举足轻重的作用，但同时也存在许多隐患，比如疫苗毒株毒力的返强造成二次感染等。随着分子生物学、遗传学及免疫学等学科的迅猛发展，口蹄疫疫苗的研究也取得了较快的进展，各种基因工程疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、核酸疫苗等不断出现，为口蹄疫的防控开辟了新的途径。本文就口蹄疫疫苗的研究概况进行综述，以期为口蹄疫的有效防控提供新的途径。

1 传统疫苗

1.1 弱毒苗

弱毒苗是指经充分致弱，但尚能在动物体内增殖，接种后能够引起动物发生无症状的感染，从而使机体产生坚强持久免疫力的病毒制剂。病毒毒力弱化途径包括雏鸡化、鼠化、兔化、鸡胚化等。该种疫苗具有价廉、成本低及免疫原性好、抗体持续时间长等优点，但其引起免疫动物病毒血症、长期带毒、排毒及病毒返强等缺点却一直无法克服，由于活疫苗具有上述缺陷，在很大程度上限制了其应用，为了使口蹄疫疫苗更安全，人们开始探索一种比较安全可靠的新苗。

1.2 灭活疫苗

灭活疫苗是指用物理或化学方法使口蹄疫病毒丧失感染力而保留抗原性，再添加佐剂后制成的制剂。灭活剂主要有甲醛、结晶紫、乙酰基乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEI）、乙基乙烯亚胺（EEI）等。灭活疫苗研究主要有3个重要环节：获取大量的病毒抗原、选择适宜的灭活剂和灭活方法、选择适宜的无毒副作用的免疫佐剂。1925年，Vallee等采集了FMDV感染牛的水疱液，经甲醛灭活，首次制成了FMD灭活疫苗。1926—1929年，Belin及其同事首次用FMD发病牛舌皮组织病料制造FMD甲醛灭活苗。1934年Schmidt和Hansen发现了无毒性且能增强免疫效力的氢氧化铝胶佐剂。1935年荷兰学者Frenkel用离体培养牛、羊、猪的胚胎皮肤，采用鸡血浆固定组织块的组织培养方法来培养FMDV获得成功。1947年，Frenkel又用牛舌上皮细胞培养法发展了自己创造的组织块Frenkel培养法，并用其增殖FMDV，使大规模病毒抗原生产技术获得成功。1952年Dulbecco首先用胰蛋白酶消化动物的肾脏皮质获得初代单层肾上皮细胞，用其培养FMDV获得成功。但是在1938年至1962年期间口蹄疫疫苗主要由动物组织生产病毒抗原，经甲醛灭活，氢氧化铝胶吸附制成［2］。自1962年至今，BHK-21细胞已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系［3］，从而广泛应用于口蹄疫疫苗生产。1965年Telling和Elsworth用发酵罐大量生产悬浮细胞来生产病毒抗原，现在几乎所有的口蹄疫灭活苗都以这种方法生产，但有研究证明甲醛在抗原的灭活中有活毒的残留，目前广泛引用的灭活剂是二乙烯亚胺［4］。目前世界上主要应用灭活苗来实现对口蹄疫的防制，除了灭火的单价苗之外，灭活二价苗也早已出现，张永光、王永录等已研制成功的牛口蹄疫O型A型双价灭活疫苗［5］。在预防牛口蹄疫方面已取得了很好的效果。但越来越多的证据表明多次口蹄疫暴发与甲醛灭活苗有关，而氮丙啶类主要作用于核酸，蛋白抗原性保持较好，但毒性较大，从而引起的应激使动物的损失也较大，另外免疫性较差，所用种毒均为强毒，必须有严密的防范设施和严格的操作规程，存在生物安全隐患，生产难度大，成本较高，使用剂量基于上述问题，迫切需要进行新的口蹄疫疫苗研发。

2 新疫苗

鉴于传统疫苗存在诸多问题，有关科学工作者结合生产实际，开展新型疫苗的研制，朝着安全、高效、多价、经济的方向发展。20世纪70年代以来，随着分子生物学、免疫化学和生物工程学的深入发展，对口蹄疫新型疫苗的研究取得了较大进展，主要有：基因工程疫苗、合成肽疫苗、活载体病毒疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗）及绿色疫苗等。

2.1 基因工程亚单位疫苗

随着生物技术在生物制品领域的应用不断深化和发展，近年成功研制了许多基因工程亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗（subunit vaccine）又称重组亚单位疫苗或生物合成亚单位疫苗，是利用DNA重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌或细胞，使其在受体高效表达，分泌保护性抗原肽链，提取保护性抗原肽链并加入佐剂制成的亚单位苗。Kleid［6］等于1981年首次将口蹄疫保护性抗原基因VP1导入大肠杆菌，制备高纯度VP1蛋白，接种牛可使牛抵抗强毒的攻击。我国台湾的Wang J H等，将大肠杆菌诱导表达的重组VP1蛋白应用SDS协助其重折叠，去除SDS，获得纯化的VP1单体和二聚体，后与口蹄疫抗体发生反应，结果表明任何一种形式的重组VP1猪用疫苗，都能产生免疫反应。郑兆鑫等利用化学法合成了口蹄疫病毒VP1基因的两种抗原表位序列，将其串联后与半乳糖苷酶基因连接成融合蛋白基因在大肠杆菌中进行高效表达，提取的融合蛋白制成亚单位疫苗免疫猪后能有效地防制口蹄疫病毒感染。而且对不同地区分离的“O”型毒株均有很好的交叉保护作用。基因工程疫苗技术是一项新兴的具有应用前景的生物技术。通过将不同血清型病毒或多种病毒的免疫原性基因偶联于同一载体，可以制成多价疫苗或多联疫苗，降低生产成本、简化免疫程序，并且多联苗还可克服不同病毒弱毒苗间产生的干扰现象，因此将是畜禽基因工程疫苗的重要方向。

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗（synthetical peptide vaccine）是依据天然蛋白质氨基酸序列一级结构用化学方法人工合成包含抗原决定簇的小肽（20～40个氨基酸），通常包含一个或多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。该疫苗是一种完全基于病原体抗原表位或者决定簇氨基酸序列特点开发设计的一类疫苗，不存在毒力回升或灭活不全的问题。特别是对于还不能通过体外培养方式获得足够量抗原的微生物病原体或虽能进行体外培养，但有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性问题的病原体意义重大。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，研究重点主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究，虽然取得了一定的进展，但仍未获得一种具有理想保护作用的合成肽疫苗。分析合成肽疫苗免疫效果不佳的原因主要有：疫苗缺乏足够的免疫原性，很难如蛋白质抗原那样诱导集体的多种免疫反应；B细胞和T细胞抗原表位很难发挥协同作用：缺乏足够多的B细胞抗原表位的刺激。合成肽作为免疫原存在的一个普遍问题是主要组织相容性复合体（MHC）的限制性，FMDV是典型的细胞依赖性体液免疫为主，单纯B细胞位点肽诱导机体产生保护性有限，因而T细胞表位的引入对提高肽段的免疫性意义重大。但T细胞表位的识别受MHC限制，非选择性T11表位或病毒蛋白不同部分的特异性Tll表位的引入可极大解决这个问题。1990年Doel［7-9］分别用A、O、C血清型FMDV VPl序列的141-158和200-213肽段组成的40个氨基酸合成肽，在牛和豚鼠进行试验，每个肽都产生高滴度的特异性抗病毒中和抗体，O、A型肽可完全保护豚鼠抵抗各同源病毒的攻击，C型较差。2002年Wang［10］等以VPl G-H环及大量侧翼序列为框架，将共有残基整合进入VPl高变区位点，并引入外源Th位点设计的合成肽疫苗，免疫猪后，以Taiwan株FMDV攻击时获得20/21保护率。

2.3 重组活载体疫苗

活载体疫苗，是将微生物保护性抗原基因即目的基因插入载体病毒如痘病毒、疱疹病毒等的特定位置上，使载体病毒转染细胞，在细胞中复制的同时表达外源基因产物即抗原。一个载体病毒中可同时插入多个外源基因，表达多种病原微生物的抗原、同时起到预防多种传染病的效果。近些年来，除了以病毒作载体以外，还有利用细菌作载体的疫苗的研究。在口蹄疫病毒载体疫苗研究中，腺病毒是应用最为广泛的载体之一。

腺病毒是一种单分子线状双股DNA病毒，基因组大小为34～43 kb，无囊膜，核衣壳呈20面体对称，由252个壳粒组成，包括240个六邻体和12个五邻体及12根纤毛。除此之外，还有其他一些小蛋白，如Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲα和Ⅳα2等。六邻体形成病毒衣壳20个三角形面，12个顶端是5个五邻体亚单位和3个纤毛蛋白共同构成的复合物，12根纤毛以五邻体蛋白为基底，由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区。五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要作用。腺病毒基因组两端各有100～140 bp的一段末端倒置重复序列（inverted terminal repeat，ITR），这些ITR是病毒复制的起始位点，是病毒复制所必需的。在左端ITR的3′侧有一段长约300 bp的包装信号（ψ），主要是介导腺病毒基因组包装病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号约0.5 kb的序列是顺式作用元件，也就是说，必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补给。近年来，口蹄疫病毒基因重组腺病毒活载体疫苗研究的比较多，已有报道多是以E1和E3编码区的AdHu5为载体，有些载体还缺失了E4编码区。Sanz-Parra等构建了表达FMDV P1编码区的复制缺陷型重组腺病毒，经鼻咽部和皮下两种免疫途径试验证明，两次免疫牛后可产生部分的保护性免疫反应。Mayr等构建了含有FMDV P1-2A-3C基因A24/A12嵌合型重组腺病毒，根据3C划分为突变型和野生型两株重腺病毒，试验证实只有3C野生型重组腺病毒能够将聚蛋白P1裂解为VP0、VP1和VP3，并刺激动物产生高水平的中和抗体，进一步证明了3C蛋白酶对衣壳组装是必需的；此重组腺病毒免疫猪体后分别于7、14、42 d用同型病毒攻击，具有很好的保护作用［11］。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗，常被称作DNA疫苗、“裸”DNA疫苗、基因疫苗、多核苷酸疫苗、基因免疫、核酸免疫、多核苷酸免疫等。即把外源的抗原基因克隆到质粒或病毒载体上，然后将重组的质粒或病毒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生以天然蛋白形式出现的抗原，激活机体的免疫系统，并能够持续地引发免疫反应。核酸疫苗作为近几年来发展起来的一项新的生物技术，无疑具有广阔的应用前景，免疫期长、成本较低、容易构建和制备、稳定性好，抗原递呈过程与病原的自然感染相似，但在短期内，DNA疫苗很难代替目前大量使用的传统疫苗，随着DNA疫苗研究的不断深入，预计不久将会有新的突破。

3 展望

随着分子生物技术的发展和在兽医领域的应用及其基因表达技术的发展，使人类有可能在生物体外合成有生理活性的蛋白质及安全有效的细胞，病原抗原将为人类及动物疾病的防治开辟广阔前景。因此可以认为在今后的口蹄疫防治方面，将可能研制生产出廉价、高效、安全的新型疫苗，为将来在世界范围内控制并最终消灭口蹄疫提供了可能。

［1］谢庆阁.口蹄疫［M］.北京：中国农业出版社，2004.

［2］杜进鑫，王永录.口蹄疫疫苗研究新进展［J］.生物技术通报，2009（3）：4-8.

［3］潘丽，张永光.口蹄疫疫苗研究进展［C］//中国畜牧兽医学会口蹄疫学分会第九次全国口蹄疫学术研讨会论文集.兰州：中国农业科学院兰州兽医研究所，2003.

［4］Bahnemann H G.Binary ethyleneimine as an inactivant for foot and mouth disease virus and its application for vaccine production［J］.J Archives of Virology，1975，47.

［5］张永光，刘在新.牛口蹄疫O型A型双价灭活疫苗研究［J］.中国兽医科技，1995，25.

［6］Kleid D G，Yansura D，Small B D，et al.Cloned viral protein vaccine for foot and mouth disease：responses in cattle and swine［J］.Science，1981，214.

［7］Doel T R，Chong W K T.Comparative immunogenicity of 146S，75S and 12S particles of foot and mouth disease virus［J］.Archives of Virology，1982，73.

［8］Doel T R，Staple R F.The elution of foot and mouth disease virus from vaccines adjuvanted with aluminium hydroxide and with saponin［J］.J Biol Standard，1982，10.

［9］Doel T R，Pullen R F.International bank for foot and mouth disease virus disease vaccine：stability studies with virus concentrates and vaccines prepared from them［J］.Vaccine，1990，8.

［10］Wang X，Zhang X，Kang Y，et al.Interleukin-15 enhance DNA vaccine elicited mucosal and systemic immunity against foot and mouth disease virus［J］.Vaccine，2008，5.

［11］孙普，卢曾军，刘在新.腺病毒载体及其在口蹄疫疫苗研究中的应用［J］.动物医学进展，2007，28.