枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰生长性能及消化酶活力的影响

仇 明 封功能 齐志涛 许 伟 杨文平 董学兴 王爱民

随着水产养殖规模的扩大，放养密度加大，养殖水体环境恶化日益加剧，生态环境遭到破坏，病毒性和细菌性疾病频繁暴发，化学药物和抗生素的连续使用，严重危害着我国水产养殖业的健康发展[1-2]。微生态制剂可调节养殖水体生态环境，避免了病原菌耐药性的产生和药物残留，并在促生长和提高动物免疫力方面有良好效果，可望成为新型绿色、环保饲料添加剂。其中，芽孢杆菌(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，能在动物肠道内生长繁殖，分泌产生多种酶类(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)及营养代谢产物(如多种氨基酸和维生素类物质等)，并具有抗菌性能好、良好的稳定性及对水产动物的益生作用和改善水产品质等特点[3]。芽孢杆菌(Bacillus)在畜禽生产中的应用已有很多报道，但是对水产动物生长的影响研究还较少。本试验通过在饲料中添加枯草芽孢杆菌，分析其对斑点叉尾鮰生长性能和内源消化酶活力的影响，为进一步研究枯草芽孢杆菌作为水产饲料添加剂的作用机理提供参考依据，以便更好地使用微生态制剂，并为实际生产人工全价饲料及投喂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼及枯草芽孢杆菌

试验用鱼为斑点叉尾鮰鱼种，均重（10.48±0.21）g，购自江苏省泰兴市水产良种场。试验用枯草芽孢杆菌，活菌量为5.0×109cfu/g，由无锡市大江中盛饲料有限公司提供。

1.2 试验饲料

按照斑点叉尾鮰鱼种营养需求设计饲料配方，自制试验饲料。在基础料 (见表1)中分别添加0、100、300、500和700mg/kg枯草芽孢杆菌。将各种原料分别粉碎过60目筛，精确称量，逐级稀释、混合，加水搅拌均匀，用小型饲料制粒机制粒，直径为2.5 mm，自然晾干，放入-20℃冰柜中冷藏备用。

表1 基础饲料配方及营养水平

1.3 试验设计与饲养管理

试验采用单因子完全随机设计，共5个处理(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组)，分别对应含枯草芽孢杆菌 0、100、300、500和700mg/kg试验饲料，其中Ⅰ为对照组。每组设置3个重复，每个重复30尾鱼。

试验在盐城工学院海洋技术循环流水养殖实验室进行。用3%的食盐水溶液对试验鱼消毒后，饲喂基础饲料驯化14 d，选择体重10.48 g左右健康的斑点叉尾鮰鱼种450尾，随机分组，放入到水族箱(规格为100 cm×60 cm×80 cm)中，正式试验从2009年6月24日至8月12日，共饲养50 d。每天投喂3次，时间为6:30、13:30和18:30，以鱼体重的2%～4%投喂。具体投饲量根据天气、水质及鱼的采食情况略微调整。投饲遵循“四定”原则，每次投喂0.5 h后观察摄食情况，使其饱食而尽量不剩饲料，如有剩余饵料及时吸出。采用微流水系统养鱼，24 h增氧，试验用水为曝气后的自来水，平均水温（25±2）℃，溶解氧大于 5mg/l，氨态氮低于0.4mg/l，pH值6.8～8.0，早晚各吸污1次，保证水质符合渔业水质标准。

1.4 样品收集和分析方法

1.4.1 取样及酶液制备

试验结束时，每箱取3尾鱼，随机取样。迅速测量体长、称体重后，置于冰盘内解剖，取出胃、肠道、胰脏，用预冷的去离子水(4℃)洗去内容物，剔除脂肪、肠系膜，用滤纸吸干后称重，然后分别加入10倍于相应重量的预冷的0.02 mol/l、pH值7.5磷酸缓冲液，测定胃蛋白酶活力时用pH值4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，冰浴匀浆，冷冻离心15 min(4 000 r/min)，取上清液即为酶的粗提液，置4℃下保存待用。

1.4.2 斑点叉尾鮰鱼种生产性能测定及计算增重率(%)=(平均末重-平均初重)/平均初重×100；蛋白质效率比=增重/(摄食量×饲料蛋白质含量)。

1.4.3 消化酶测定方法

采用福林-酚试剂法测定蛋白酶活力，蛋白酶活力单位[μg/(g·min)]定义为1 g组织在30℃、pH值7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。采用淀粉酶检测试剂盒(南京建成)测定淀粉酶活力，淀粉酶活性单位(U)定义为1 g组织在30℃、pH值7.0的条件下，每分钟水解1mg的淀粉为1个淀粉酶活力单位。采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法测定脂肪酶活性，脂肪酶活性单位[μg/(g·min)]定义为 30 ℃、pH 值 7.0的条件下，每分钟催化产生1 μg分子脂肪酸的酶量为1个酶活力单位。

1.5 数据统计与分析

原始数据经Excel 2007初步整理后，用统计分析软件SAS8.0进行单因素方差分析 (One-Way Anovy)，LSD法进行多重比较，结果用平均值±标准误（±S.E.）表示。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种生产性能的影响（见表2）

表2 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰的增重率和蛋白质效率比的影响

由表2得知，随着枯草芽孢杆菌的添加量的增加，斑点叉尾鮰鱼种平均末体重、平均增重率、蛋白质效率比呈先升高后略微降低的相同变化趋势。试验组平均末均重比对照组分别增重了4.23%、8.54%、10.55%、9.18%，除试验Ⅱ组外，其它试验组均显著高于对照组(P＜0.05)；试验Ⅳ组增重的幅度最大，增重率比对照组显著提高了46.29%(P＜0.05)；试验组蛋白质效率比分别比对照组提高了14.42%、24.04%、35.58%、27.88%。

2.2 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种蛋白酶活力的影响（见表3）

表3 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种蛋白酶活力的影响

由表3可知，随着饲料中枯草芽孢杆菌添加量的增加，斑点叉尾鮰鱼种的肠道、胃、胰脏中蛋白酶活力都呈先不同程度的提高后呈著性降低的相似变化趋势(P＜0.05)。其中，试验Ⅱ组的肠道、胃、胰脏中蛋白酶活力比对照组有所增加，但差异都不显著(P＞0.05)，而试验Ⅲ组的斑点叉尾鮰鱼种肠道中的蛋白酶活力比对照组提高了65.39%，试验Ⅳ组胃、胰脏中蛋白酶活力分别比对照组提高了37.51%、177.68%，差异显著(P＜0.05)。说明了饲料中添加枯草芽孢杆菌能提高斑点叉尾鮰消化道中蛋白酶活性，且添加量适宜时，肠道和胰脏中的蛋白酶活力提高幅度较大。

2.3 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种淀粉酶活力的影响（见表4）

表4 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种淀粉酶活力的影响

由表4可知，随着饲料中枯草芽孢杆菌添加量的增加，斑点叉尾鮰鱼种肠道中淀粉酶活力呈先提高后略有下降，再显著性增加(P＜0.05）的曲线变化趋势，其中试验Ⅴ组增加的幅度最大，比对照组提高了30.51%；胰脏中淀粉酶活力略有下降后呈显著性增加(P＜0.05），试验组Ⅴ增加的幅度最大，比对照组提高了42.86%。说明了饲料中添加枯草芽孢杆菌能提高斑点叉尾鮰肠道和胰脏中淀粉酶活力，增强对饲料中糖类营养物质的消化吸收。

2.4 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种脂肪酶活力的影响（见表5）

由表5可知，随着枯草芽孢杆菌添加量的增加，肠道中脂肪酶活力呈先提高后降低的变化趋势，其中试验Ⅲ组最高，比对照组增加了61.04%。试验Ⅳ组胃脂肪酶活力最高，比对照组增加了43.33%，达到显著性增加(P＜0.05）。试验Ⅳ组胰脏中脂肪酶活力最高，比对照组增加了48.47%。说明了饲料中添加枯草芽孢杆菌能提高消化道中脂肪酶活力，促进鱼类对饲料中脂类物质的消化吸收。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种生长性能的影响

付天玺研究发现，添加1.0×1011和3.0×1011cfu/kg凝结芽孢杆菌饲料组奥尼罗非鱼的增重率和蛋白质效率较对照组有显著的提高[4]。华雪铭等研究表明，用0.2%芽孢杆菌能最有效地提高彭泽鲫对饲料蛋白的利用[5]。本试验结果表明，添加100～700mg/kg枯草芽孢杆菌后饲料中蛋白质效率比提高了14.42%～35.58%，促进斑点叉尾鱼鮰鱼种生长，体重增加4.23%～10.55%，增重率提高24.69%～46.29%，节约饲料，提高养殖效益。本研究还发现，并不是添加枯草芽孢杆量越多越好。推测可能原因是在正常情况下，水产动物肠道微生物种群及其数量处于一个动态的微生态平衡，饲料添加芽孢杆菌量过少，不能形成优势种群，即达不到添加的效果；过多，则会破坏这种平衡，导致肠道内菌群比例失调，生产性能下降。

3.2 枯草芽孢杆菌对斑点叉尾鮰鱼种消化酶活性的影响

自Sogarrd等[6]报道芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有消化酶活性以来，国内在20世纪末开始研究微生态制剂对水产动物消化酶活性的影响。如丁贤、潘康成、Pan、刘小刚等研究了芽孢杆菌及其它微生态制剂能提高凡纳滨对虾、鲤鱼、银鲫的消化酶活力[7-10]。本试验结果表明，在斑点叉尾鮰鱼种饲料中添加300～500mg/kg枯草芽孢杆菌能提高消化道中蛋白酶、脂肪酶的活力;添加500～700mg/kg枯草芽孢杆菌能提高消化道中淀粉酶活力。说明饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌能够提高鱼类消化酶活力。

目前，有关消化酶活力高低与鱼类生长之间的关系尚无定论。伍莉等研究认为，斑点叉尾鮰消化道蛋白酶、淀粉酶的活力大小与鱼的生长速度没有某种线性关系，即消化酶活力越大，生长速度并不一定越快[11]。而丁贤研究表明，对虾生长与消化酶活力之间存在一定的正向作用关系，即生长速度随着酶活的增加而增大的关系[7]。本试验结果认为，饲料中添加枯草芽孢杆菌能提高消化酶活力，显著提高蛋白质效率、特定生长率，促进鱼的生长，降低饵料系数。

分析芽孢杆菌促进鱼体生长的原因，一方面是由于微生态制剂在宿主消化道内定植、繁衍、代谢后，可以产生一些消化酶活性物质。已有研究表明，动物摄食了添加芽孢杆菌的饲料后，肠道内能产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶等，补充了内源酶的不足，提高了消化道酶的活性，从而促进机体消化系统对营养成分的消化和吸收，提高消化效率[12-13]。但具体是益生菌刺激了肠道消化酶的分泌，还是由于所添加的益生菌本身所产生的胞外酶起作用或是这两种情况共同作用，还有待进一步探讨。另一方面，枯草芽孢杆菌在其生长、繁殖过程中，又能自身合成VC、VB1、VB2和VB6以及氨基酸等营养物质，为动物提供营养物质，促进其生长，提高生产性能[14]。

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[4]付天玺,许国焕,吴月嫦,等.凝结芽孢杆菌对奥尼罗非鱼消化酶活性、消化率及生长性能的影响 [J].淡水渔业,2008,38(4):30-35.

[5]华雪铭,周洪琪.芽孢杆菌对彭泽鲫饲料蛋白质利用的影响[J].饲料研究,2008(1):57-58.

[6]Sogarrd D H,Denmark A S.Microbials for feed beyond lactic acid bacterial[J].Feed Inter.,1990,11(4):32-37.

[7]丁贤,李卓佳,陈永青,等.芽孢杆菌对凡纳对虾生长和消化酶活性的影响[J].中国水产科学,2004,11(6):580-584.

[8]潘康成,何明清,刘克琳.微生物添加剂对鲤鱼生长和消化酶活性的影响研究[J].饲料工业,1997,18(10):41-42.

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[11]伍莉,陈鹏飞,罗绍禄,等.不同添加剂对斑点叉尾鮰肠道蛋白酶、淀粉酶活力的影响[J].饲料研究,2002(1)：4-7.

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