微生物除草剂的研究与应用进展

叶 非，冯 理

（东北农业大学理学院，哈尔滨 150030）

有数据表明，全世界大约有三十万种杂草广泛分布，其中约1 800余种杂草所造成的产量损失占每天粮食总产量的9.7%[1]。过去的半个世纪，化学除草剂已经成功地控制了各种各样的杂草，同时大大减轻了劳动强度，提高了工作效率。但是化学除草剂的大量使用也带来了许多负面效应，如污染环境、易对人畜产生毒害以及产生抗性杂草等，除草剂的研制与使用在不断受到环境和生态的制约。因此，寻求更安全有效的除草制剂或使用方法已成为当今除草剂发展的方向。微生物除草剂具有资源丰富、环境污染小等优点，符合了可持续农业的发展要求，近年来取得了显著的研究成果，引起了人们的广泛关注。

1 微生物除草剂概述

狭义的微生物除草剂是指“直接利用微生物本身进行杂草防治”；广义而言，微生物除草剂是指利用能快速繁殖的杂草病原菌活体或由微生物产生的具有杀（抑）草毒性的代谢产物来开发的杂草生防制剂。由杂草病原菌的繁殖体和适宜的助剂组成的微生物制剂叫做活体微生物除草剂。利用微生物所产生的对植物具有毒性的代谢产物进行杂草防治的除草剂叫做微生物源除草剂，也叫做农用抗生素除草剂[2-3]。

目前，人们利用微生物及其代谢产物来防治杂草是生物防治研究中一个较活跃的领域。利用活体微生物直接作为除草剂控制杂草的策略有两大类：①传统的和淹没式的微生物防除法；②应用微生物除草剂技术。传统的做法主要通过从杂草的原产地引入寄主专一性天敌微生物，在田间接种释放引起目标杂草的病害流行，最终建立能使自己永久存在的调控机制，天敌需要1～3年的时间才能充分控制杂草种群；淹没式策略是用大量天敌微生物“淹没”杂草，从而在当年获得防治效果，但这种策略要求天敌微生物的释放时间与杂草的敏感期一致，并确切知道天敌微生物对寄主快速反应的时期。澳大利亚1995年引进马达加斯加岛的无眠单胞锈菌（Maravalia cryptostegiae）防治入侵植物桉叶藤（Cryptostegia grandiflora），该菌在第一年内传播距离就超过了100 km，随后其种群数量即呈线性增长，在之后的3年内，在距离最近的释放地550 km的地点可以见到该菌[4]。而应用微生物除草剂技术实际上是一种改进过的淹没式策略，即在产品的形式和应用技术上和化学除草剂类似，又区别于通常意义上的淹没式释放。它是将杂草的致病菌进行大量培养，制成标准化的制剂，当杂草处于敏感生长阶段时，于苗前或苗后施用，人为制造杂草病害大流行，从而减小杂草对作物的影响。

利用微生物源物质来开发新型除草剂具有许多潜在优势：①这类除草剂作用位点是现有除草剂未涉及到的，有利于杂草的抗性治理；②这些微生物天然代谢产物可以为新的合成方案提供线索；③在低浓度时微生物代谢产物比合成的化合物具有生物活性的可能性大；④微生物代谢产物在环境中的半衰期比合成农药短得多，易迅速降解或解毒，因此登记试验比化学农药所用的时间短、资金少；⑤植物细胞培养技术、发酵技术、分子遗传学和基因工程的不断发展，把生产昂贵的微生物代谢产物防除杂草变成了现实[5]。

2 活体微生物除草剂

目前，活体微生物除草剂是国外研究和开发的热点，这是由于它有许多化学除草剂所不具备的优点：①微生物资源丰富，繁殖速度快，生产周期较短；②对人、畜、天敌等非靶标生物安全，而且不污染环境；③由寄主杂草分离得到的植物病原菌对寄主植物一般具有种间特异性，选择性高。

已报道的有除草潜能的微生物类型主要是：真菌、细菌、病毒等。具有杂草生物防治的真菌主要集中在9个属：① 刺盘孢菌属（Colleototrichum）；② 疫霉属（Phytophthora）；③ 镰刀菌属（Fusarium）；④ 交链孢霉属（Alternaria）；⑤ 柄锈菌属（Puccinia）；⑥ 尾孢霉属（Cercospora）；⑦ 叶黑粉菌属（Entyloma）；⑧ 壳单孢菌属（Ascochyta）；⑨ 核盘菌属（Sclerotinia）[6]。其中交链孢霉属（Alternaria）的研究报道最多。

国外对真菌防除杂草的研究很多，在对真菌除草剂的新菌株筛选以及商品化产品开发等方面的研究成果显著。第一个注册的真菌除草剂是1981年在美国登记的Devine制剂，它是将棕桐疫霉菌（Phytophthora palimivora）的厚垣孢子制成悬浮剂，用于土壤处理防治柑桔园莫伦藤（Mottonia odorata）和其他多年生作物田中的有害葡萄树，其防效达96%。Collego制剂是由美国开发的已商品化的最成功的茎叶处理真菌除草剂，它是将长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeo-sporiocide f.sp.aeschynomene）的孢子加工成可湿性粉剂，用以防除水田和大豆田中的弗吉尼亚田皂角（Aeschynomene virginica），大田常规使用防效在90%以上。日本Tasmart的活性成分为稗内脐蠕孢（Drechslera monocera），用于防治水稻田中的稗草，该药剂为油状液和粉末的组合包装，在稗草2叶期时有效，该药剂对部分禾本科作物有影响[7]。

1963年，我国山东省农业科学院科技人员研制成功的真菌除草剂“鲁保一号”，是在大豆菟丝子上分离得到的一种寄生性病原菌—胶孢炭疽菌菟丝子专化型，适用于防治蔬菜、大豆、亚麻、瓜类等作物田中所发生的菟丝子。中国水稻研究所通过对稗草禾长蠕孢（Helminthosporium gramineum f.sp.echinochloae）的研究，成功开发了一种真菌制剂，对稗草的防治效果可达到80%[8]。表1列举出了一些已开发和具有开发潜力的真菌类除草剂[9-15]。

表1 已开发和具有开发潜力的真菌除草剂Table 1 Some developed and potential mycoherbicide

从杂草根系土壤的微生物菌群中筛选出的具有除草活性的细菌也可以作为开发微生物除草剂的重要资源，正日益受到广泛的重视。具有除草潜能的根际细菌（Rhizobacteria）主要集中于8个属：①假单孢菌属（Pseudomonas）；② 肠杆菌属（Enterobacter）；③黄杆菌属（Flavobacterium）；④柠檬酸细菌属（Citrobacter）；⑤无色杆菌属（Achromobacter）；⑥ 产碱杆菌属（Alcalligenes）；⑦ 欧文氏菌属（Erwinia）；⑧ 黄单胞细菌（Xanthomonas）。其中黄单孢菌属（Xanthomonas）既是重要的植物病原菌，也是工业上应用较多的一类细菌[16]。

除此之外，利用病毒防治杂草也有很多实例，例如Lpp-1病毒可用来防治水中的蓝绿藻等水生杂草，在容积为3.8 m3贮水池中接种100 mL该病毒制剂，7 d内可使藻类数量明显下降[20]。Charudattan等发现了一种能控制严重危害美国东南部牧场和草地等自然区域杂草热带苏打苹果（Tropical Soda Apple；TSA）的烟草花叶病毒（Tobacco mild green mosaictobamovirus），这种病毒能引起系统的超敏感反应，从而杀死TSA的幼苗和成熟植株。它被认为是防除TSA的高效微生物除草剂，有待成为第一个病毒类的微生物除草剂产品[21]。

3 微生物源除草剂（农用抗生素除草剂）

微生物能产生很多代谢产物，这些产物中含有杀草活性物质，因而微生物源除草剂具有许多人工合成的传统除草剂无法比拟的优点：①化学结构新颖，一般为经典的农药化学合成难以发现的潜在的新型植物毒性化合物；②与活性微生物除草剂相比，更易储存、利于剂型加工和使用方便；③天然植物毒素一般为多靶标作用位点和方式，不容易引起杂草抗性的产生；④选择性强，有相当一部分为寄主专化性毒素，易于在环境中降解，大多对哺乳动物低毒，对非靶标生物较安全；⑤开发和登记等费用低于化学除草剂[22]。

利用微生物的代谢产物开发微生物源除草剂，在日本的研究最为活跃。第一个开发成商品除草剂的微生物产物为双丙氨膦（Bilanafos），它是由从土壤中分离的链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）产生的，一种非选择性内吸传导型茎叶处理除草剂，广泛用于防除一年生和多年生禾本科杂草及阔叶杂草。AAL-毒素是Abbas等发现的侵染番茄的交链孢菌致病变种产生的代谢产物，它是一种高效的植物毒素[23]。最近，细菌梨火疫病菌（Erwinia amylovora）的天然蛋白质产物Messenger作为真菌剂获得了注册，使得该领域的研究上升到开发蛋白质源除草剂及其相应的作用方式。例如，利用尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）产生的真菌蛋白能杀死阔叶杂草而其对单子叶植物很安全[24]。此外，已知的具有除草活性的抗生素还有除草菌素（Herbicidin）、绿僵菌素（Destruxin E）、杆孢菌素（Roridins）和疣孢菌素（Verucarins）等。表 2列举了一些已开发和具有开发潜力的微生物代谢产物[3,25]。

近年来我国也在微生物源除草剂领域开展了大量研究工作并取得了一些显著成果。南京农业大学杂草研究室万佐玺，强胜等研究人员在研究紫茎泽兰病害时成功分离、筛选出了紫茎泽兰自然致病真菌链格孢菌（Alternaria alternata（Fr.）Keissler），认为其代谢产物具有开发为农用抗生素除草剂的潜力[26]。通过进一步研究发现这种高活性真菌使紫茎泽兰致病的主要原因是它产生的毒素AAC-Toxin，施药5 h，就可导致杂草萎蔫，4 d可以完全杀死杂草。研究人员据此模拟合成并筛选出系列化合物，研发出我国首个具有自主知识产权的微生物源除草剂技术—“敌散克”（Disancu）。该除草剂专用于农田杂草马唐及其稗草、狗尾草和千金子等禾本科杂草的防除，对目标杂草控制效果可以达到90%，有很好的生物防治应用前景。张金林等发现葱叶枯病菌毒素可以强烈抑制禾本科杂草种子萌发，其中对马唐的防效与百草枯药效相当[27]。经过进一步研究，研究人员又从15株灰霉病菌株BC-4中分离出了三株具有较强除草活性的菌株，在100 mg·L-1浓度下可以抑制马唐生长，在50 mg·L-1浓度下能完全抑制马唐和反枝苋种子发芽[28]。姜述君等通过色谱技术从狭卵链格孢菌株AAEC0523中分离到一淡黄色的油状毒素，对稗草的种子萌发和幼苗生长都有较强的抑制作用，作为微生物源除草剂具有较好的开发潜力[29]。上述工作的开展，填补了我国在农用抗生素除草剂这一领域的研究空白，扩大了我国微生物代谢产物的研究范围，为微生物除草剂的研制开辟了新的领域。

表2 已开发和具有开发潜力的微生物代谢产物Table 2 Some developed and potential microbial metabolites

4 微生物除草剂存在的问题和发展前景

虽然近年来有不少微生物除草剂获得了专利授权，但通过商品生产登记的还很少，与农业及环境保护实际应用的需求存在很大的差距。主要原因是微生物除草剂在其研究、开发和应用中存在着一些突出的问题和不足，困扰着微生物除草剂的发展：①工厂化大规模生产的条件不成熟，微生物除草剂的培养和加工技术等无法建立统一的标准；②植物形成的次生物质往往是一组化学结构类似的相关化合物，不仅分离提取和化学成分的确定难度相当大，而且工作量也很大；③很多微生物除草剂对目标生物的选择性极强，作用靶标单一，推广及大规模生产受到限制；④通常微生物除草剂对环境条件的要求比化学除草剂更苛刻，容易导致微生物除草剂防效较低，见效较慢；⑤活性物质不稳定，菌株变异退化，致病力减弱，制剂加工困难等诸多问题。

尽管微生物除草剂存在上述问题，使其推广及大规模生产受到限制，但是随着生物科学技术的迅速发展和科学家们对微生物除草剂研究的逐步深入，一些问题已经得到解决。例如：①通过适当的助剂类型及制剂加工技术可以促进和调节孢子萌发，增加致病性，减少对环境依赖性，提高防治效果和稳定性；②通过基因导入和细胞融合技术可以重组自然界存在的优良的除草基因，改良潜在除草作用的特殊酶的基因，以此来提高致病力和药效[30-31]；③选择两种或两种以上的微生物作为一种单独的除草剂防治多种杂草，改良了微生物除草剂的品种和寄主专一性等。此外，由于某些根际细菌的固氮作用能够减少施用化学肥料的费用，开发同时有固氮作用的细菌除草剂将会产生较大的经济效益。以上这些研究的广泛开展，为进一步的微生物除草剂的开发提供了可能，相信未来，将会有更多的活体微生物及其代谢产物实现商品化。

[1]Li Y Q,Sun Z L,Zhuang X F,et al.Research progress on microbial herbicides[J].Crop Protection,2003,22(2)∶247-252.

[2]李海涛,王金信,杨合同,等.微生物除草剂的研究现状和应用前景[J].山东科学,2005,18(1)∶30-34.

[3]吴文君,高希武.生物农药及其应用[M].北京∶化学工业出版社,2004.

[4]Tomley A J,Evans H C.Establishment of,and preliminary impact studies on,the rust,Maravalia cryptostegiae,of the invasive alien weed,Cryptostegia grandiflora in Queensland,Australia[J].Plant Pathology,2004,53(4)∶475-484.

[5]马娟,董金皋.微生物除草剂与生物安全[J].植物保护,2006,32(1)∶9-12.

[6]付颖,叶非.生物源除草剂研究与使用进展[J].农药,2002,41(5)∶7-17.

[7]Hirase K,Kangetsui M,Yoshigai S,et al.Effect of temperature on herbicidalpropertiesofMTB-951,amycoherbicideto control Echinochloa crus-galli L.[J].Weed Biology and Management,2004,4(4)∶213-217.

[8]李新,谢明,谭万忠,等.杂草生防真菌的研究进展[J].中国生物防治,2009,25(1)∶83-89.

[9]Pomella A W V,Barreto R W,Charudattan R.Nimbya alternantherae a potential biocontrol agent for alligatorweed,Alternanthera philoxeroides[J].BioControl,2007,52(2)∶271-288.

[10]Müller-Stover D,Kroschel J.The potential of Ulocladium botrytis for biological control of Orobanche spp.[J].Biological Control,2005,33∶301-306.

[11]Abu-Dieyeh M H,Watson A K.Efficacy of Sclerotinia minor for dandelion control∶effect of dandelion accession,age and grass competition[J].Weed Research,2007,47(1)∶63-72.

[12]陈勇强,但汉斌,郭富常.国外微生物除草剂的研究及应用现状[J].天津农业科学,1998,4(2)∶5-9.

[13]Ericson L,Burdon J J,Müller W J.The rust pathogen Triphragmium ulmariae as a selective force affecting its host,Filipendula ulmaria[J].Journal of Ecology,2002,90(1)∶167-178.

[14]Shabana Y M.The use of oil emulsions for improving the efficacy of Alternaria eichhorniae as a mycoherbicide for waterhyacinth(Eichhornia crassipes)[J].Biological Control,2005,32(1)∶78-89.

[15]Défago G,Ammon H U,Cagán L,et al.Towards the biocontrol of bindweeds with a mycoherbicide[J].BioControl,2001,46(2)∶157-173.

[16]孙巍,张蕾,吴迪,等.微生物除草剂的研究进展与展望[J].微生物学杂志,2006,26(2)∶88-91.

[17]Boyetchko S M.Principles of biological weed control with microorganism[J].HortScience,1997,32(2)∶201-205.

[18]冀营光,邱健,李承光,等.细菌除草剂的发展现状与展望[J].生物技术,2006,16(1)∶88-90.

[19]但汉斌,陈永强,魏雪生,等.从杂草DRB中筛选微生物除草剂的研究[J].微生物学通报,2002,29(4)∶5-9.

[20]史建伟,薛怀清.杂草防除的生物策略[J].世界农业,2002(7)∶41-43.

[21]Charudattan R.Tobacco mild green mosaic virus∶a virus-based bioherbicide.Bioherbicides∶The Next,Generation,Canberra[R].2003-04-27.

[22]沈寅初,张一斌.生物农药[M].北京∶化学工业出版社,2000.

[23]Abbas H K,Tanaka T,Duke S O,et al.Susceptibility of various crop and weed species to AAL-toxin,a natural herbicide[J].Weed Technology,1995,9(1)∶125-130.

[24]陈燕芳,丁伟,丁吉林,等.天然产物除草剂研究进展[J].杂草科学,2007(2)∶1-6.

[25]顾成波,赵长山.微生物及其天然产物防止杂草的发展及展望[J].农药科学与管理,2003,24(2)∶19-21.

[26]万佐玺,强胜.链格孢菌的毒素培养条件及其毒素的致病范围[J].中国生物防治,2001,17(1)∶10-15.

[27]张金林,董金皋,樊慕贞,等.葱叶枯病菌Stemphylium botryosum毒素的分离与除草活性研究[J].农药学学报,2001,3(2)∶60-66.

[28]ZhangJL,ZhangLH,LiuYC,etal.Theherbicidalactivityofmutant isolates from Botrytis cinerea[J].Agricultural Sciences in China,2006,5(8)∶622-628.

[29]姜述君,范文艳,鞠世杰,等.狭卵链格孢菌株AAEC0523及毒素对稗草的致病性[J].植物保护学报,2007,34(3)∶283-288.

[30]Charudattan R,Dinoor A.Biological control of weeds using plant pathogens∶accomplishments and limitations[J].Crop Prot,2000,19(8)∶691-695.

[31]Gronwald J W,Plaisance K L,Wyse D L.Essessment of Pseudomonas syringae pv.tagetis as a biocontrol agent for Canada thistle[J].Weed Science,2002,50(3)∶397-404.