猪akirin2基因的克隆与真核表达

曹金锁,柳 超,蒋朋飞,赵振华,陈新雨,张德礼

(西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室生物信息研究中心分子病毒免疫与肿瘤系统生物学研究组,陕西 杨凌 712100)

先天性免疫是机体防御病原体感染的第一道防线,而ak irin2是先天性免疫系统的一个重要功能基因[1-2]。Akirin2蛋白严格定位于细胞核,参与NF-κ B通路,但其作用机制尚未明确。小鼠akirin2基因敲除试验表明,Akirin2蛋白是Toll样受体,肿瘤坏死因子和白介素1受体信号通路中的重要核因子[1]。体外细胞转染试验证实,该蛋白的过量表达能明显促进IL-6和其他免疫因子的表达[1,3]。为探讨akirin2基因在猪体内的功能,本研究结合生物信息学方法和分子生物学试验,依照人akirin2基因序列克隆到猪源a k irin2基因,对基因进行染色体定位预测与蛋白进化分析,从序列本身掌握ak irin2基因特点。构建真核表达载体成功进行瞬时转染,为深入研究ak irin2奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织和细胞来源 健康长白猪的脾脏;猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC)为张彦明教授馈赠;pEGFP-C1质粒为本实验室保存。

1.2 试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司;RTPCR试剂盒购自Fermentas;Taq DNA,内切酶SalⅠ和BamHⅠ均购自TaKaRa(大连)公司;抗GFP抗体,胶回收试剂盒购自天根公司;羊抗鼠 IgG/HRP购自北京博奥森公司;质粒提取试剂盒购自Omega公司;Lipofectamine 2000 Regent购自Invitrogen公司;胎牛血清购自 Hyclone公司;DMEM细胞培养基购自Gibco公司。

1.3 猪akirin2基因的电子克隆与引物设计 登陆NCBI,以人 a k irin2基因(NC_000006.11)为种子序列,在猪EST数据库中进行比对拼接得到猪a kirin2基因预测序。设计引物为上游5′-GAGTCGAC ATGGCGTGCGGAGCTACT-3′,下游 5′-GACGGGA TCCGTCATGAAACATAACTAGCAG -3′,GTCGAC:SalⅠ酶切位点;GGATCC :BamHⅠ酶切位点。

1.4 akirin2基因的克隆和鉴定 取健康长白仔猪的脾脏,采用Trizol法提取总RNA,RT-PCR法得到ak irin2的编码区,将 PCR产物与 pMD-18TSimple载体连接,菌液送到北京三博远志生物技术公司进行测序。

1.5 ak irin2基因序列分析 在线软件(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp)预测 NLS(Nuclear localization signal)[4],使用APSSP2在线软件(http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2)对蛋白二级结构进行预测[5]。CluxtalX 1.8软件将多物种的Akirins蛋白序列进行多序列比对,使用MEGA4.0软件做进化树[1-6]。

1.6 ak irin2基因真核载体的构建与鉴定 将pMD-akirin2重组质粒进行SalⅠ和BamHⅠ双酶切,pEGFP-C1质粒经过同样的双酶切和胶回收,将pEGFP-C1和目的片段akirin2在 T4连接酶作用下4℃过夜,转化至感受态细胞DH5α中,将重组质粒送至北京三博远志生物技术公司进行测序。

1.7 SUVEC培养和质粒转染细胞 培养猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),细胞形态为铺路石状,用含10%胎牛血清的高糖DMEM进行培养,每3 d传代1次。将细胞培养在六孔板中,按照脂质体2000操作说明进行转染,24 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞生长情况[8]。

1.8 Western blot检测目的蛋白 参照《分子克隆实验指南》做Western blot检测目的蛋白,一抗为抗GFP抗体(工作浓度为1∶2000),二抗为羊抗鼠IgG/HRP(工作浓度为1∶3000)。

2 结果

2.1 通过RT-PCR法得到目的序列 从猪脾脏中提取RNA,经RT-PCR扩增得到与预期大小相一致的核酸片段。

2.2 序列分析结果 猪Akirin2编码203个氨基酸,第22～27位氨基酸(PKRRRC)序列为核定位序列,该蛋白以Coil(无规卷曲)和α-Helix(α-螺旋)为主。猪akirin2基因被准确定位在猪第1号染色体上,此段猪基因组序列登陆号为CU633759,在第164313-185326位之间。外显子分别编码78个氨基酸,48个氨基酸,50个氨基酸和27个氨基酸。3个内含子大小分别为16441 bp,2406 bp和1358 bp。

2.3 猪Akirin2蛋白进化分析 最小进化法构建的无根进化树显示:猪的Akirin2蛋白与牛的Akirin2蛋白保持高度的同源性。同时各物种间的Akirin2进化保守型要高于 Akirin1。进化树明显分为三大部分:无脊椎动物的Akirin,脊椎动物的Akirin1和脊椎动物的Akirin2[1-3]。图中符号标示:Dm,(果蝇);Ag,(按蚊);Am,(蜜蜂);Tc,(赤拟谷盗);Gg,(鸡);Hs,(人);Mm,(小鼠);Xl,(爪蟾);Dr,(斑马鱼);Bt,(牛);Ss,(猪)。

2.4 真核重组质粒pEGFP-Akirin2瞬时转染结果在转染24 h后,使用荧光倒置显微镜观察转染的SUVEC细胞。a和b分别为重组质粒转染的SUVEC细胞,a为荧光下细胞形态,b为同一细胞区域自然光下细胞形态;c为空 pEGFP-C1质粒转染SUVEC细胞结果。d为未转染的EC细胞。通过荧光观察初步判定目的蛋白已在SUVEC细胞中表达。见图2。

图2 pEGFP-Akirin2和pEGFP-C1转染SUVEC细胞24 h后荧光显微镜检测(100×)

2.5 Western blot检测结果 Akirin2蛋白分子量为22.5 ku,EGFP蛋白自身蛋白分子量为27 ku,则EGFP-Akirin2融合蛋白分子量为 49 ku左右。Western blot检测出的融合蛋白大小与预期分子量一致,证明EGFP-Akirin2融合蛋白在SUVEC细胞中得到表达。见图3。

3 讨论

图3 Western blot检测

比较基因组学与基因数据库的共享为基因识别提供了条件。人基因组与猪基因组存在较高的同源性,以人的基因序列为种子序列,在猪EST数据库和基因组数据库中进行猪新基因的识别与克隆,为研究猪感染与免疫新基因提供新途径。本研究通过分子生物学技术得到猪Akirin2完整编码区证实了猪ak irin2基因确实存在。将编码区与猪基因组序列比对,结合内含子首尾的GT-AT规律,确认猪akirin2基因含有4个外显子并定位于猪1号染色体。这一结果可为研究Akirin2蛋白功能提供参考价值,为研究各个外显子功能和Akirin2蛋白构象提供帮助。通过构建多物种Akirin进化树为研究各物种之间的进化关系提供佐证,为从进化角度研究低等动物与高等动物之间Akirin调控异同提供数据。本试验成功将a k irin2基因构建到pEGFPC1真核表达载体上,实现猪 a k irin2基因在SUVEC细胞中的瞬时表达,保持了Akirin2蛋白的原有构象,为进一步研究akirin2基因功能奠定基础。由于猪和人的基因组序列和蛋白质有着高度同源性,因此以猪为模型研究哺乳动物免疫调控机制,将直接为研究人体相应蛋白提供数据支持。单独的Akirin2蛋白并不起作用,因此要完全了解Akirin2的功能还需要同时研究多个免疫相关基因[1]。

[1]Goto A,Matsushita K,Gesellchen V,et al.Akirins are highly conserved nuclear proteins required for NF-kappaB-dependent gene expression in drosophila and mice[J].Nat Immunol,2008,9(1):7-9.

[2]Galindo R C,Doncel-Pe′rez E,Zivkovic Z,et al.Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates[J].Dev Comp Immunol,2009,33:612-617.

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[6]Kumar S,Tamura K,Nei M.MEGA3:integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J].Brief Bioinform,2004,5:150-163.