利用菌落多重PCR方法进行不同动物来源多杀性巴氏杆菌鉴定的研究

赵 耘,杜昕波,李伟杰,陈 敏,康 凯

(中国兽医药品监察所,北京 海淀 100081)

多杀性巴氏杆菌是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体,主要使动物发生出血性败血症或传染性肺炎。本菌广泛分布于世界各地。在同种或不同动物间可相互传播,也可感染人。Carter G R等根据荚膜抗原的不同将本菌分为A、B、D、E和F五个血清型[1]。多杀性巴氏杆菌不同型之间其生物学差异很大,主要表现毒力和流行病学方面,各血清型之间交叉免疫保护性较低。已经证明KMT1基因是多杀性巴氏杆菌种特异性基因,而A、B、D、E荚膜型的特异基因则分别是 hyaD、bcbD、dcbD和 ecbJ基因[2-3]。本研究参照文献报道针对上述特异基因合成6对引物建立多重PCR方法,并利用所建立的多重PCR方法对我所保存的48株不同动物来源的多杀性巴氏杆菌进行鉴定和荚膜血清型分型,同时与间接血凝试验以及Biolog细菌快速鉴定系统进行比对,以期为巴氏杆菌病的临床快速诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 多杀性巴氏杆荚膜型菌参考菌株,引自英国皇家兽医学院,现由中国兽医药品监察所菌种保藏中心保藏,多杀性巴氏杆菌分离菌株43株由中国兽医药品监察所菌种保藏中心保藏具体信息见表3;支气管败血波氏杆菌CVCC3000、胸膜肺炎放线杆菌CVCC259、大肠埃希菌CVCC195由中国兽医药品监察所菌种保藏中心保藏。

1.2 菌株培养 将冻干保存的多杀性巴氏杆菌用适量马丁汤溶解,接种改良马丁琼脂斜面,37℃过夜培养,取斜面培养物划线接种改良马丁琼脂平板(含4%马血清和0.1%血红素)、普通琼脂平板以及麦康凯琼脂平板,37℃培养24 h;支气管败血波氏杆菌和大肠杆菌是用适量的营养肉汤溶解冻干菌株,接种普通琼脂斜面,37℃过夜培养,取斜面培养物划线接种普通琼脂平板,37℃培养24 h;胸膜肺炎放线杆菌是用适量添加0.02%辅酶I(NAD)、8%灭活小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)溶解冻干菌株,接种添加0.02%辅酶Ⅰ(NAD)、8%灭活小牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)斜面,37℃过夜培养,取斜面培养物划线接种添加0.02%辅酶Ⅰ(NAD)、8%灭活小牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板。分别取多杀性巴氏杆菌培养物涂片、革兰染色。单菌落直接作为PCR反应的模板进行菌落PCR。

1.3 Biolog鉴定 参照文献报道的方法进行[4]。

1.4 间接血细胞凝集试验 参照文献报道的方法进行[1]。

1.5 PCR引物合成 参考文献报道的引物序列[2-3],由上海Invitrogen公司合成。将各引物浓度稀释至 25 μ mol/L置-20℃保存备用。引物的序列为:KMTF:ATCCGCTATT TACCCAGTGG,KMTR:GCTGTAAACGAACTCGCCAC,AF:TG CCAAAATCGCAGTCAG,AR:TTGCCATCAT T GTCAGTG,BF:CAT TTATCCAAGCTCCACC,BR:GCCCGAGAGT T TCAATCC,DF:TTACAA AAGAAAGACTAGGAGCCC,DR:CATCTACCC ACTCAACCATATCAG,EF:TCCGCAGAAAAT TATTGACTC,ER:GCT TGCTGCTTGAT T TTG TG,FF:AATCGGAGAACGCAGAAATCAG,FR:T TCCGCCGTCAATTACTCTG。

1.6 PCR扩增 PCR反应体系为 50μL,依次加入 10×PCR 缓冲液(含25 mmol/L MgCl2)5μL、6对引物(25 μ mol/L)各 1μL 、dNTP(2.5 μ mol/L)4μL 、Taq 酶(5 U/μ L)1μL 、双蒸水 28μL,用灭菌枪头挑取平板上的单个菌落,悬浮于各PCR反应液中。PCR反应条件为:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸 1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 特异性检测 利用以上方法分别对支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌进行多重PCR,以检测其特异性。

1.8 多重PCR的初步应用 将本所保存的48株多杀性巴氏杆菌分别进行菌株培养、菌落多重PCR,并与Biolog细菌快速鉴定系统和间接血凝试验结果进行比较。

2 结果

2.1 多杀性巴氏杆菌的菌体形态和培养特性 48株多杀性巴氏杆菌分离株与参考菌株在添加血红素和血清的改良马丁琼脂平板上生长良好,菌落为中等大小、淡灰白色、圆润、光滑、边缘整齐、闪光的露珠状小菌落;在麦康凯琼脂平板上不生长;在普通琼脂平板上生长贫瘠。显微镜下可见各菌株均为革兰阴性球杆菌。

2.2 Biolog鉴定结果 Biolog鉴定中相似性(SIM)和位距(DIS)是2个重要的参数,表示测试结果与数据库相应数据的匹配程度。当SIM＞0.75,DIS＜5.0时,为良好的匹配;SIM 值越接近于1,鉴定结果的可靠性越强。通常在SIM值大于0.5时,就可以确定菌株的分类地位。结果48株菌株SIM值均大于0.5,85%菌株DIS小于5,这表明48株菌株均为多杀性巴氏杆菌(表略)。

2.3 间接血凝试验结果 各菌株间接血凝试验结果见表1。共进行了43株多杀性巴氏杆菌的间接血凝试验,结果10株猪源多杀性巴氏杆菌5株为B型,3株为A型,2株为D型;15株禽源菌株均为A型;5株牛源和2株羊源菌株均为B型;2株马源菌株1株为A型,1株为B型;3株兔源菌株2株为D型,1株为A型(结果见表1)。

2.4 定型参考菌株多重PCR结果 如图1所示,5株定型参考菌株均扩增出了约460 bp的DNA片段 ,同时 CVCC390、391、392 、393、395 菌株还分别扩增出约 1044 bp 、760 bp、657 bp、511 bp、851 bp的DNA片段。此多重PCR结果表明,这5株定型参考菌株均为多杀性巴氏杆菌,CVCC390菌株为A型,CVCC391菌株为B型,CVCC392菌株为D型,CVCC393菌株为E型,CVCC395菌株为F型。而用此方法对支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌进行多重PCR,结果均未扩增出相应的目的片段。

图1 定型参考菌株多重PCR结果

2.5 多重PCR的初步应用 如表1所示,利用此多重PCR方法对42株多杀性巴氏杆菌分离菌株进行扩增,结果所有菌株均扩增出了种特异片段,23株菌株扩增出了A型菌的特异片段,14株菌株扩增出了B型菌的特异片段,5株菌株扩增出了D型菌的特异片段(电泳图略)。

2.6 多重PCR与间接血凝试验以及Biolog结果的比较 此多重PCR方法同时可以进行种和荚膜型的鉴定,本研究利用此多重PCR方法对47株多杀性巴氏杆菌进行了种和荚膜型的鉴定,结果47株菌株均扩增出了相应的种特异性片段,此结果与Biolog鉴定结果完全一致,二者符合率为100%(CVCC477菌株未进行多重PCR扩增)。同时各菌株利用此多重PCR方法分别扩增出了相应的荚膜型特异性片段(结果见表1),这与间接血凝试验结果完全一致,二者符合率为100%。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌广泛分布于世界各地,可感染多种家畜、家禽、野生动物和野禽,引起发病或死亡,对我国畜牧业的发展危害严重。目前,被国内外学者公认的血清学鉴定方法有2种,其一是Carter G R根据荚膜抗原的不同,将多杀性巴氏杆菌分为A、B、D、E、F等5个血清群[1];其二是 Heddleston K L根据耐热抗原的不同将多杀性巴氏杆菌分为1、2、3……16等16个血清型[5]。这些方法均存在费时、费力,敏感性较低等缺点。因此,建立特异敏感的PCR分型诊断方法是非常必要的。本研究利用6对特异引物建立了多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F 5型菌株和种特异的菌落多重PCR方法,并对42株多杀性巴氏杆菌进行了鉴定,同时与Carter G R间接血凝试验方法进行比对,结果猪源菌株5株为B型,3株为A型,2株为D型;禽源菌株均为A型;牛羊源菌株均为B型;马源菌株1株为A型,1株为B型;兔源菌株2株为D型,1株为A型。这与吴范庚等的报道一致[6]。同时此多重PCR方法与Carter G R间接血凝试验结果二者符合率为100%。

本研究中所用的Biolog微生物自动分析系统主要是根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等碳源的利用情况进行鉴定。其与传统鉴定方法相比具有操作简便、快速、鉴定范围广的特点。Biolog的数据库包括细菌、酵母和丝状真菌在内近2000种微生物,囊括了动植物病源细菌400多种。目前本方法已成为本中心细菌鉴定常规方法[7]。本研究利用此方法和多重PCR方法进行比对,结果二者符合率为100%。

[1]Cater G R.Studies on Pasteurella multocida.I.A hemagglutination test for the identification of serological types[J].Am T Vet Res,1955,16:481-484.

[2]Townsend K M,Boyce J D,Chung J Y,et al.Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(3):924-929.

[3]T ownsend K M,Boyce J D,Frost A J,et al.Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(4):1096-1100.

[4]Biolog.MicroLogTM System Release 4.2 User Guide[M].Hayward:CA,2001.

[5]Heddleston K L,Gallagher J E,Rebers P A.Fowl cholera:gel diffusion precipitin test fo r serotyping Pasteurella multocida from avian species[J].Avian Dis,1972,16:925-936.

[6]吴范庚.我国多杀性巴氏杆菌血清型综述[J].中国兽医杂志,1993,19(1):50-52.

[7]杜昕波,赵耘,李伟杰,等.利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究[J].中国兽药杂志,2008,42(9):31-33.