狂犬病毒HEP-Flury株基质蛋白的原核表达及纯化

江 飙，郑佳琳，邝贞结，梁红茹，徐 蕙，郭霄峰

(华南农业大学兽医学院，广东广州510640)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)是一种能引起人和动物高度致死性的嗜神经病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属，基因组从3'端至5'端依次排列5种结构蛋白，即核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和转录酶蛋白(L)[1]。其中M为RV最小的结构蛋白，共202个氨基酸，占病毒总蛋白的11%。M蛋白能够连接核衣壳和病毒膜，在1位～72位氨基酸残基之间存在一个抗原决定簇，该部位与RV的免疫反应有关。另外，由于糖蛋白的羧基端插入其中，因此它可以直接影响糖蛋白在病毒包膜表面的构型，在病毒形态形成中都起着重要作用[2]，并且平衡、调节病毒的转录与复制[3]。

本研究通过PCR扩增和定向克隆方法构建重组表达质粒，利用大肠杆菌表达出带有6×His标签的RV基质蛋白，为狂犬病诊断方法的建立奠定了良好的基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、载体及主要试剂 pHEP-3.0(含有RV的HEP-Flury株全基因序列)由日本国立传染病研究所Morimoto教授惠赠。原核表达载体pQE30、鼠抗RV多克隆抗体、E.coilJM109和M15(pREP4)为华南农业大学兽医微生物实验室保存。凝胶回收试剂盒、鼠抗His单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG购自天根生化科技(北京)有限公司。pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、KpnⅠ、HindⅢ为宝生物工程(大连)有限公司产品。KOD plus DNA聚合酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品，Prestained Protein Ladder为Fermentas公司产品。His-Trap FF crude购自GE公司。

1.2 引物设计 根据HEP-Flury全基因序列(AB085828)，设计了1对引物，RV-M1(5'-GGGGT ACCATGAACTTTCTATGTA-3')和RV-M2(5'-CCCA AGCTTTTATTCTAAAAGCAGAG-3')。上下游分别引入KpnⅠ与HindⅢ酶切位点，扩增的DNA片段长度为626 bp，涵盖了M基因完整的ORF。

1.3 pQE-M重组质粒的构建 以HEP-Flury株全长基因组质粒为模板，扩增出M的ORF片段，PCR条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经回收纯化后，克隆至pMD18-T载体，筛选阳性克隆并对其进行序列测定。鉴定正确的克隆双酶切，定向克隆至pQE30表达载体，转化E.coilJM109，并用PCR和酶切和测序方法对插入片段进行鉴定。

1.4 重组基质蛋白的诱导表达与鉴定 将重组质粒pQE-M转化至E.coliM15(pREP4)，挑取单个菌落扩增后采用不同的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导前OD600nm值、培养基抗生素浓度等进行条件优化。同时设立含pQE30空载体及未诱导的重组质粒转化菌作为对照。重组蛋白按试剂使用说明采用鼠抗His单克隆抗体、鼠抗RV多克隆抗体和HRP标记羊抗鼠IgG进行western blot鉴定。

1.5 重组基质蛋白的分离与纯化 取菌液以1∶100的体积比采用优化的表达条件进行大量表达，收获菌体后用含8 mol/L尿素的磷酸盐缓冲液悬浮菌体沉淀并超声破碎，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清过HisTrap FF crude柱。蛋白与柱内Ni2+充分结合后，用含20 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗去杂蛋白，用含500 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集，进行SDS-PAGE鉴定，并用紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度。

2 结果与讨论

2.1 pQE-M重组质粒的构建 用RV-M1、RV-M2引物对M基因进行PCR扩增，电泳结果显示，扩增出约600 bp的DNA片段，与预期片段626 bp大小相符。与表达载体pQE30连接后对PCR阳性的克隆质粒进行双酶切，也获得大小相符的片段(图1)。

2.2 重组M蛋白的诱导表达与鉴定 将表达产物进行SDS-PAGE电泳，结果显示在约25 ku处出现一条新的蛋白条带，其大小与带有6×His标签的重组M蛋白一致(图2)。凝胶薄层扫描表明，优化条件后诱导表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的13%。

Western blot结果显示，重组M蛋白能够被鼠抗His单克隆抗体(图3A)及鼠抗RV多克隆抗体(图3B)特异性识别，而作为对照的空载体pQE30表达产物、未诱导重组质粒转化菌均没有条带出现。虽然大肠杆菌在10℃～43℃范围内都能够生长并合成蛋白，但研究发现，37℃时细菌生长活跃，合成的蛋白量高，与此同时蛋白酶活性也很高，容易造成蛋白质的降解，因此该温度下的环境并不利于外源蛋白的大量表达，在图2泳道1中，37℃下表达量较高，但呈现明显的弥散现象；低温条件下虽然包涵体的形成能够被抑制，可以诱导表达一些可溶性蛋白，但细菌生长缓慢，表达量很少[4]，在图2泳道3中可见各条带清晰，但表达量较低。在本研究中，经多次优化诱导发现，不同的IPTG浓度、诱导时间、诱导前OD600nm值等条件下表达量未出现明显的变化。而不同的诱导温度下表达量则有较大的不同：37℃时由于温度高，诱导产物出现了较大程度的降解；而28℃诱导表达量较高，并且没有出现明显的降解现象；细菌在16℃下生长缓慢，表达量很低。

作为真核生物的结构蛋白要进行原核表达，需要考虑到其基因中存在较多稀有密码子，如真核生物中编码精氨酸(Arg)的常见密码子agg、aga，编码亮氨酸(Leu)的常见密码子cta等在大肠杆菌中就缺乏相应的tRNA。有研究显示，这些稀有密码子大量或连续性的出现可能会产生表达量的降低等不利影响[5]。RV的M蛋白中仅编码精氨酸的稀有密码子就有13组，并在编码第117位、118位氨基酸处出现两组稀有密码子连续的成簇现象，这也许是本研究的重组外源蛋白在大肠杆菌中未能获得更高表达量的重要原因。图3B中在比目的蛋白小的位置上出现了一条较浅的特异性条带，其原因在于由于稀有密码子相应的tRNA数量稀少，其存在可大大降低蛋白质合成的速率，甚至使蛋白合成中途停止[6]，导致出现了截短的蛋白。

RV的M蛋白在病毒的装配及细胞表面的芽生过程中起重要作用[7]，该蛋白两端的亲水区、中心区及与病毒囊膜结合的疏水区在各毒株间高度保守[8]。本研究利用原核表达系统，通过优化表达条件后得到了带有6×His标签的M蛋白并将其分离纯化。狂犬病作为一种致死性的烈性人畜共患传染病，其防治及监控是人类控制该病的重要手段。在常见的诊断、检测及研究中，相关抗原有未经纯化的RV颗粒、纯化的RV或纯化的RV结构蛋白等，由于M蛋白在病毒形态形成、复制、转录过程中均起着重要的作用，因此表达的M蛋白有助于对RV进行深入的研究。

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