卷烟过滤嘴降解菌的筛选及其降解效果的电镜观察

2010-07-31孙毓临刘明洋刘爱军曾清如

中国烟草科学 2010年3期

孙毓临，谭英，刘明洋，刘爱军，曾清如*

（1.湖南农业大学资源环境学院，长沙 410128；2.湖南中烟有限责任公司长沙卷烟厂，长沙 410128）

我国是世界最大的烟草生产国与消费国[1]，巨大的生产量与销售量，不仅带来了经济效益，同时也给环境带来污染。数量庞大的过滤嘴直接进入土壤或水体，也给环境的自我净化造成了巨大压力。

自卷烟滤嘴问世 50年来，科研人员做了大量的试验，试图开发出更加安全的滤嘴，其关注焦点一是能从卷烟烟气中除去更多的有害成分，二是能保持卷烟的烟味[2-3]，对过滤嘴材料在环境中的降解及转化行为的研究鲜有报道。

目前卷烟滤嘴的主要原料是二醋酸纤维[4]，由其做成的卷烟过滤嘴材料，弹性好，无毒无味，热稳定性好，吸阻小，截滤效果显著，能选择性地吸附卷烟中的有害成分，同时又保留了一定的烟碱而不失卷烟口味。二醋酸纤维是葡萄糖单元中的羟基与乙酸发生了酯化反应的产物[5]，要了解卷烟过滤嘴在环境中的行为，纤维素的降解是关键。纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状大分子聚合物，是地球上最丰富的多糖物质，主要是通过微生物分泌的纤维素酶对其进行降解。但由于生产纤维素酶的成本很高、对环境很敏感，很难直接应用。所以，一般应用的是分离筛选得到的纤维素分解菌。目前已有一些关于分离用于发酵的纤维素菌的报道。赵永勋等[6]将分离筛选到的3株酶活力较高的菌株接种到有机废弃物堆肥中，结果发现接种菌剂可以加快有机废弃物中纤维素的分解并使有机肥的养分含量迅速提高。冯明谦[7]等分离筛选了芽孢杆菌、霉菌、放线菌，接种后可明显缩短垃圾堆肥发酵时间。对于不同的分解材料、不同气候条件、不同发酵工艺等，纤维素菌种类等的要求也有较大差异，特别是改性纤维素的化学性质与原纤维素相比有很大的不同，对其被微生物分解的机理也应有所差别。笔者基于生物降解原理，从土壤和不同材料的堆肥中分离筛选出高效稳定的纤维素分解菌，利用电子扫描显微镜来探讨卷烟过滤嘴纤维素的降解过程与机理，以便用来改良过滤嘴材料，加快卷烟过滤嘴在环境中的分解过程。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂

菌种来源：自然界朽木、半腐枯枝落叶处污泥和温室大棚周边的土壤。

供试试剂：KC1，NaC1，K2HPO4，NH4Cl，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H20，琼脂，蛋白胨，牛肉膏，生理盐水，丙酮，戊二醛，醋酸异戊酯。

50%膜：为长沙卷烟厂自行研发的一种改良过滤嘴材料。先用1%醋酸浸泡24 h，用碘液检查确定无淀粉后，再用 2%苏打水冲洗至中性，晾干后待用。

1.2 实验仪器

DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；LDZX-40型不锈钢立式电热蒸汽压力消毒器(上海申安医疗器械厂)；LD5-2A型台式离心机(长沙市八方科学仪器有限公司)； ZHWY-2102型双层大容量全温度恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；PYX-800Q-B型人工气候箱(广东韶关科力实验仪器有限公司)；超净工作台；扫描电镜(日本电子)；电子天平等。

1.3 培养基[8-10]

初选平板培养基、复选平板培养基及用来保藏菌株的斜面培养基均为普通牛肉膏蛋白胨固体培养基。富集培养基组成为：KC1 0.5 g， K2HPO42.0 g， NH4Cl 6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H20 痕量，50%膜0.2 000 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。降解培养基组成为基本同富集培养基，50%膜添加量为0.100 0 g。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株的筛选与分离纯化从自然界中不同地点采集朽木、土壤、半腐枯枝落叶、污泥等样品，分别放入三角瓶中，加入适量的无菌水，振荡 30 min，静置30 s后取上清液1 mL，分别接种至50mL的富集培养基中。在30 ℃，150 r/min 的培养箱中振荡培养5 d，再以2%的接种量接入到新鲜的富集培养基中。经过 3～5次的富集纯化培养，从中选择纤维素膜条崩溃程度较高、崩溃速度最快和效果稳定的富集培养液进行菌株分离纯化培养。

取0.2 mL 的富集培养液涂布到初筛平板培养基上，翻转培养皿于 30 ℃的人工气候箱中静置培养。待菌种长出后，选取生长快、菌苔厚、未污染的菌落，用划线法接入到复筛平板培养基上，并进行纯化培养，得到可以降解50%膜的两株纯菌株，分别命名为SUN-2和SUN-5，并接入斜面培养后冷冻保藏。

1.4.2 纤维素分解效果的测定菌悬液的制备：斜面菌种接入富集培养基，于30 ℃，150 r/min 条件下振荡培养，控制OD500为0.500 左右，备用。

对改性纤维素膜的降解：按 2%的接种量将两菌株的菌悬液分别接入降解培养基，另设同条件下加入无菌水的对照组，每组3个平行，于30 ℃的人工气候箱中静置培养，观察50%膜的崩解效果。每4 d（即第3,6,9,12,15 天）取出一批样品。50%膜取出后，先用蒸馏水淋洗浸泡10 min，再于真空干燥箱中干燥 3 d，用万分之一的天平进行精确称重，根据50%膜重量的减轻程度，可以判断出该50%膜的降解程度，同时对降解过的50%膜进行电镜观察。

1.4.3 菌株及 50%膜的扫描电镜观察按照文献[11]进行。

2 结果

2.1 降解效果动态

对分别经过SUN-2和SUN-5降解的50%膜进行观察，肉眼可见50%膜上出现崩溃小孔，且有毛边，同时培养液中出现粉末状的纤维，培养液变浑浊，呈乳白色。而对照组则无此变化。对降解后的50%膜进行称重，计算降解率，结果如图1所示。

从图中可以看出，SUN-2和SUN-5对50%膜的降解率在第三天即能达到30%以上，说明这种改性纤维素膜具有较好的生物可降解性。但此后，降解率无明显增长，可能是因为剩余的材料无法被菌株利用或者利用率较低。

图1 SUN-2和SUN-5对50%膜的降解率Fig.1 Degrading ratio of SUN-2 and SUN-5

2.2 50%膜降解前后的扫描电镜观察

2.2.1 50%膜降解前的扫描电镜观察图2为50%未被降解时的扫描电镜图片。从图中可知，50%膜在未降解前，其表面较光滑，部分区域相对粗糙，有泡状或者片状突起。

图2 50%膜降解前电镜扫描所见表面Fig.2 SEM image of 50% film before degraded

2.2.2 50%膜被 SUN-2降解后的扫描电镜观察图3是经过菌株SUN-2的降解后50%膜的扫描电镜图片，对比50%膜未被降解时的图片可知，50%膜表面已经遭受了侵蚀，由相对光滑变得非常的粗糙，整片50%膜出现不规则裂痕，有小块的50%膜已经被菌株降解而脱离下来，使50%膜表面出现明显的凹凸不平。

2.2.3 50%膜被SUN-5降解后的扫描电镜观察图4是SUN-5降解后50%膜的扫描电镜图片，对比图1可知，50%膜表面出现了水纹状裂痕，说明菌株对50%膜具有一定的降解效果。另外，对比图3可以发现，经过菌株SUN-2降解过的50%膜，其粗糙程度要高于菌株SUN-5降解过的50%膜，说明菌株SUN-2对50%膜的降解作用要比SUN-5强。

图3 SUN-2降解两周后电镜扫描所见50%膜表面Fig.3 SEM image of 50% film degraded by SUN-2

图4 SUN-5降解两周后电镜扫描所见50%膜表面Fig.4 SEM image of 50% film degraded by SUN-5

2.3 菌株的扫描电镜观察

2.3.1 菌株 SUN-2的扫描电镜形态特征通过肉眼观察发现：菌株SUN-2形成的菌落呈圆形，米白色，表面较干燥，易挑起。图5为SUN-2的扫描电镜照片，从照片可以看出，菌株细菌呈球状，无鞭毛，大小较均匀，分布较分散，菌体表面粗糙，全部为单生，没有对生、链生形式的细菌，且在菌株SUN-2中没有发现单层细菌成群排列。

图5 单生的SUN-2菌株Fig.5 The solitary form of SUN-2

2.3.2 菌株 SUN-5的扫描电镜形态特征通过肉眼观察发现，菌株SUN-5形成的菌落呈圆形，隆起，橙黄色，边缘光滑整齐，黏稠易挑起。图6为SUN-5的扫描电镜照片，从照片可以看出，菌株细菌呈椭球型，无鞭毛，大小较均匀，但体积比SUN-2小。菌体表面光滑，一端较另一端圆钝或靠近一端有带状突起。菌株SUN-5分布较集中，大部分为链生，有少量单生菌存在，且大部分的链生菌株以4个菌株组成的细菌链存在，有少量细菌对生。