黄连汤有效部位对鸭疫里氏杆菌的抑菌率

纪丽莎，殷红福，汪丽芬，张先福

（浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安311300）

鸭疫里氏杆菌Riemerella anatipestifer病，也称鸭传染性浆膜炎，是鸭的一种细菌性传染病，死亡率达30%～50%。该病以纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、输卵管炎、关节炎、脑膜炎等为主要病变特征［1－2］。鸭疫里氏杆菌具有21个血清型，各血清型相互之间没有交叉免疫力，免疫预防效果不佳［3－5］；且鸭疫里氏杆菌对各类抗生素极易产生耐药性［6－7］，在很多地区已经难以找到对鸭疫里氏杆菌敏感的药物。鉴于此，我们前期试验筛选出对鸭疫里氏杆菌病具有显著效果并由黄连Coptis chinensis，黄柏Phellodendrion amurense和甘草Glycyrrhiza uralensis 3味中药组成的中药复方黄连汤［8］。经HPLC 测定，黄连汤有效成分分别为小檗碱 299.73 mg·kg－1，药根碱 108.66 mg·kg－1，甘草酸 9.00 mg·kg－1，盐酸小檗碱 5.7 g·kg－1，盐酸巴马汀 254.00 mg·kg－1（中草药已录用）。为了进一步研究黄连汤对鸭疫里氏杆菌中外膜蛋白的作用，本研究开展了黄连汤提取物对鸭疫里氏杆菌的抑菌率研究，为中药抗菌机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药材 黄连、黄柏和甘草均购自浙江省临安市中医院。

1.1.2 菌株及试剂 鸭疫里氏杆菌，由浙江省农业科学院畜牧研究所提供，由笔者所在实验室进行扩增培养。胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）［9］作为基础培养基，配制固体培养基时，另按15 g·kg－1加琼脂粉，制成胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）。

1.1.3 仪器与设备 UV-2450型精密紫外分光光度计（岛津国际贸易有限公司），恒温培养箱（杭州蓝天化验仪器厂），全自动高压灭菌锅（广州东南科仪有限公司）

1.2 方法

1.2.1 中药原料处理 采用水提醇沉法：取黄连2 g，黄柏2 g，甘草4 g放入烧杯中，加适量的水，浸泡，煮沸后用小火持续20～30 min（视药物而定）；滤出煎液，滤渣加水，进行第2次煎煮（20～30 min）；滤出煎液，合并2次滤液，用纱布过滤，得滤液75.0 mL，加入体积分数为95%乙醇225 mL，4℃下静置24 h，滤纸过滤除沉淀，在75℃下减压回收乙醇，85℃下继续浓缩得原药34.8 mL，药液含生药229.9 g·L－1，微孔滤膜过滤除菌后，放置在－20℃冰箱保存备用。

1.2.2 鸭疫里氏杆菌的复苏和菌悬液的制备［10］在TSB肉汤培养基中加入15 g·kg－1琼脂，加热溶解，121℃高压灭菌20 min，倾倒在平板培养皿内，以此用作冻干菌株的复苏平板培养基。利用平板划线法将冻干菌株接种至平板内，37℃，培养24 h后，挑取单个生长的菌落，转种至TSB肉汤培养基，振荡培养12 h。此为菌悬液。

1.2.3 扩增培养 取培养12 h的菌悬液100 μL，加至装有TSB的肉汤培养基中，37℃恒温箱，分别培养0，2，4，6，8和10 h，对各个时间段的生长菌落进行计数，并测定吸光度值。

1.2.4 菌落计数和吸光度值的相关性分析 采用平板菌落计数法［11］。将定时培养的菌液进行10－1，10－2，10－3，…，10－7，10倍递增稀释，然后分别取不同稀释度的菌液100 μL滴加于胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）平板上，用无菌涂棒涂布均匀，每个稀释度重复3块平板，37℃温箱中培养12 h。统计平板上生长的活菌数，乘以稀释倍数，再乘以10，即为菌浓度（×1010个·L－1）。定时吸取适量菌液和参比液，将参比液调0后，测定菌悬液的吸光度DO600。该试验设3次重复。

1.2.5 药物稀释与菌液接种 取无菌试管，将黄连汤原液与培养基按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7的体积比稀释，药物质量浓度分别为115.0，77.0，57.0，46.0，38.0，33.0和29.0 g·L－1，分别放置到各个试管中。接种菌悬液20，50，120，190和250 μL到各组配制好的试管药液中。置于37℃，180 r·min－1的恒温摇床中培养12 h。该试验设3次重复。另取1支含菌悬液的试管作对照，此为净生长量。

1.2.6 抑制生长率的计算 将不同药物的光密度值代入到鸭疫里氏杆菌生长曲线的线性关系方程式中，计算抑制生长率。抑制生长率=（细菌净生长量－处理净生长量）/细菌净生长量×100%。

1.3 数据分析

试验结果用Excel处理，用SPSS 11.0统计软件对试验数据进行ANOVA分析和回归分析［12］。

2 结果与分析

2.1 鸭疫里氏杆菌浓度标准曲线

细菌在培养了0，2，4，6，8和10 h后，取3.0 mL细菌悬液与参比液，进行吸光度DO600测定，以吸光度为横坐标，以菌浓度为纵坐标（ × 1010个·L－1），绘制标准曲线［13］（图1）。

曲线方程为y=0.485 1e1.9068x，R2=0.981 1。将其化为线性模型后进行显著性检验，得F=156.006＞F0.01（1，3） =34.1，说明在 0.01 水平上两者相关性显著，线性关系良好。

图1 鸭疫里氏杆菌的吸光度和菌浓度的标准曲线Figure 1 Curve between OD values and the concentration of Riemerella anatipestifer

2.2 不同质量浓度中药浸提物对不同菌量的抑制效果

通过肉眼观察，菌量为20 μL时药物质量浓度在33.0 g·L－1时液体出现混浊，38.0 g·L－1时有絮状物；菌量在50和120 μL时，药物质量浓度大于38.0 g·L－1时液体较清澈，但46.0 g·L－1有絮状物；菌量在190和250 μL时，药物质量浓度在38.0 g·L－1时，液体出现混浊，在57.0和46.0 g·L－1都有絮状沉淀，但57.0 g·L－1透明度大于46.0 g·L－1。从结果可以看出，黄连汤有抑菌效果，但其抑制效果不能得出确切数值。现通过定量的方法来测定抑制率。紫外分光光度计测定各菌量的吸光度值见表1。

表1 不同药物质量浓度下对应的吸光度Table 1 OD values of various drug concentrations corresponding

从表1中可以看出，除第7组外，随着药物质量浓度的增大，吸光度依次递减，抑制率依次增大，但第7组的吸光度值小于第6组。将以上吸光度值数据代入到曲线方程中，得到各吸光度对应的菌浓度（表2）。

由表2说明，药物质量浓度在29.0 g·L－1时，95%的菌已经被抑制。菌浓度小于0.7×1010个·L－1时，液体已经处于澄清透明。横向对比，除第1组和第2组外，第3组到第7组随着菌量的增加，菌浓度依次增大。将以上菌浓度通过抑菌生长率公式求得各质量浓度对应的抑菌率（表3）。

通过上表可见，通过纵向对比，菌量在20和50 μL时，药物质量浓度的显著性差异出现在第3组，菌量在120，190和250 μL时，药物质量浓度的显著性差异出现在第4组，与肉眼观察不相吻合。各个菌量的抑菌率分别为99.99%，99.98%，99.99%，99.98%和99.98%，抑菌率都在99.98%以上。

表2 药物质量浓度作用下对应的菌浓度Table 2 Bacterial content of under the action of various drug concentrations

表3 黄连汤有效部位抑菌率Table 3 Antibacterial rate of ethanol extracts of Coptidis rhizoma Decoction against Riemerella anatipestifer

3 讨论

从表1中可以看出，除第7组外，其余药物质量浓度组随着药物质量浓度的增大，吸光度值依次递减，抑制率依次增大，但第7组的吸光度值小于第6组。药物质量浓度在77.0 g·L－1时抑菌效果最佳。试验说明，药物质量浓度越大抑制细菌的效率反而会减弱，可能因为中药是由多种复杂成分构成，不是所有成分都直接作用于致病菌达到抑制细菌的目的，有些成分会因为药物质量浓度的增高起到自身抑制的效果，故中药的抑制率反而会减少，甚至有些中药的抗菌有效成分在体外抑菌试验中测不出或显示不强，但在体内却有较好的抑菌效果（如鱼腥草Houttuynia cordata）［14］。前期试验已经证明，鸭疫里氏杆菌对人工发病鸭具有显著的治疗效果。

通过肉眼观察，菌量为20，50，120，190和250 μL时，对应的含有絮状物的药物质量浓度分别为38.0，46.0，46.0，57.0和57.0 g·L－1。由表2的数值可以看出，絮状物都出现在0.5×1010～0.6×1010个·L－1，是抑制与非抑制的临界值，可能是细菌在生长时与药物对抗直至被杀死后所产生细菌死亡之后的菌体变为絮状物，而大于临界值的细菌未被抑制住，会使菌液混浊；小于临界值的细菌被药物抑制，使液体澄清透明。死亡之后的菌体给实验人员的判读带来了不便的影响，测定细菌吸光度值，具有定量准确、方法简便及重复性好等优点。

通过表2可以看出，在20 μL菌量时，第1组的菌浓度为227×1010个·L－1，远远低于对照组5 017×1010个·L－1，抑制率为95.00%。同样，在第2组里，只有24×1010个·L－1个细菌。这可能是因为药物作用后，细菌崩解，破裂，胞质流出，体积变小，减少了混浊度，从而减少了吸光度。这说明药量在很少的情况下，都有很大的抑制效果。下一步做药物对细菌外膜蛋白的提取时，选药物质量浓度为 29.0 g·L－1的即可。

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