超声波提取银杏叶中黄酮类化合物的研究

杨荣华，任京东，屈云霞

（泰山医学院，山东泰安 271016）

银杏叶提取物化学成分复杂，主要活性成分为黄酮类化合物及萜类内酯。目前国际上公认的银杏叶制剂的含量标准为黄酮类化合物≥24%，银杏内酯≥6%[1]。现代药理研究表明，黄酮苷能有效地清除体内有毒过氧自由基的作用，具有降低血脂、促进血液循环及脑代谢功能；银杏萜类内酯除了具有扩张冠状动脉血管、增加血流量、改善脑营养和抗菌作用外，还具有较强的血小板活化因子抑制作用，因此具有较高的药用和经济价值[2]。

银杏叶中有效成分的提取常用的方法为有机溶剂浸取法、水浸取法、超临界流体萃取法、高速逆流色谱技术提取法、细胞组织培养合成法、树脂吸附法、酶提取法等[3]。各种方法均有其特点，但存在提取时间长、效率低、溶剂用量大或设备复杂、成本高等缺点，而超声波提取具有设备简单、提取方便、效率高、节能环保等优点，已广泛应用于植物有效成分的提取[4]。本研究利用超声波对银杏叶中黄酮类化合物进行提取，用分光光度法测定总黄酮的含量，并对提取条件进行了单因素和正交试验分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（日本岛津）；KS-80高速万能粉碎机；R-201恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；DHG-9076A电热鼓风干燥箱；回流冷凝装置；PHS-3C型精密pH计（上海第三分析仪器厂）。

1.2 试药

芦丁对照品（批号：200915347，中国药品生物制品检验所）；银杏叶（取自泰安岱庙内银杏树，九月采集新叶，经清洗、干燥后粉碎成粗粉，经鉴定为银杏叶）；无水乙醇（分析纯，天津化工厂）；氢氧化钠（化学纯固体，上海化学试剂公司）。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备

2.2.1 常规溶剂提取法 取10 g银杏叶于回流冷凝装置中，用70%乙醇溶液作为提取溶剂，在提取温度70℃、固液比为1∶20、提取剂pH值为8的条件下回流提取4 h[5]。将提取液浓缩并定容，得到样品溶液。

2.2.2 超声波提取法 取10 g银杏叶放入回流冷凝装置中，加入一定浓度的乙醇溶液做溶剂，然后将实验装置放入超声设备中，在一定条件下进行正交试验，超声提取银杏叶中黄酮类化合物，将提取液过滤、浓缩后定容，得到样品溶液。

2.2 标准曲线的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10.00 mg，以30%乙醇定容到50 ml量瓶中，即得质量浓度为0.2 mg/ml的标准液。 分别移取上述芦丁标准液0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 ml于6只25 ml量瓶中，用30%乙醇补充至12.5 ml，加入1 mol/L氢氧化钠5 ml，用30%乙醇稀释至刻度，10 min后于330 nm处测定吸光度A，以试剂作为空白参比。测得不同质量浓度下各标准溶液吸光度值，用最小二乘法作线性回归，得到芦丁质量浓度与吸光度的关系曲线的回归方程[6-7]：

式中，ρ：黄酮质量浓度（mg/ml）；相关系数 r=0.9996。

2.3 不同样品总黄酮浓度及提取率测定

移取提取液1 ml，置于25 ml量瓶中，按照上述操作加试剂后，过滤，在330 nm处测出各样品的吸光度，代入标准曲线求出所含黄酮的质量浓度。分别按以下公式求出银杏叶中总黄酮类化合物的提取率：

式中，V：提取液的体积，单位为ml；P：提取液含黄酮的质量浓度，单位为mg/ml；m1：银杏叶的质量，单位为mg。

2.4 提取溶剂及浓度的确定

常用的银杏叶提取溶剂主要有水、甲醇、乙醇、丙酮等，由于甲醇、丙酮溶剂毒性较大，而水的提取率较低，故选用乙醇作为提取溶剂。称取10 g干燥并粉碎的银杏叶，在超声功率为80%、超声时间30 min、溶剂用量为银杏叶量12倍的条件下， 当乙醇浓度为 0、20%、30%、40%、50%、60%、70%时超声提取1次，将得到的提取液定容，移取一定量的试样测量总黄酮的提取率。结果见图1。

图1 乙醇浓度对黄酮类化合物的提取率的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

由图1可知，提取率随乙醇浓度增加而增加，虽然高浓度乙醇作为溶剂可得到更好的提取率，但考虑到成本亦将随之大幅度提高，而且用30%乙醇提取率已经达到0.9%以上，再提高乙醇浓度提取率增加幅度较小，所以本实验选择30%乙醇作为提取溶剂。

2.5 超声波功率对提取率的影响

超声提取过程中，超声波功率大小是影响最终黄酮含量的重要因素。称取10 g干燥并粉碎的银杏叶，在超声时间30 min、乙醇浓度30%、溶剂用量为银杏叶量12倍的条件下超声提取1次，考察超声功率对总黄酮提取率的影响。见图2。

图2 超声波功率对黄酮类化合物的提取率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids

由图2可知，提取率随超声波功率的增加而增加，当达到90%以上时效果最好，由于所用超声波器功率较低，故采用100%效果更好。

2.6 超声时间对提取率的影响

称取10 g干燥并粉碎的银杏叶，在超声功率为80%、乙醇浓度为30%、溶剂用量为银杏叶量12倍的条件下超声提取 1 次，每次选取时间为 15、30、45、60、75、90 min 的条件，考察超声时间对银杏叶中总黄酮提取率的影响。结果见图3。

图3 超声时间对黄酮类化合物的提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids

由图3可知，提取率随超声时间的增加而增加，当超声时间达45 min时提取率已达0.96%以上，45 min以后增加幅度明显降低。

2.7 溶剂用量对提取率的影响

称取10 g干燥并粉碎的银杏叶，在超声功率为80%、超声时间30 min、乙醇浓度为30%的条件下，选取m（乙醇）∶m（银杏叶）=6、8、10、12、14、16、18 的条件，考察溶剂用量对银杏叶中总黄酮提取率的影响。结果见图4。

图4 溶剂用量对黄酮类化合物的提取率的影响Fig.4 The effect of consumption of solvent on the extraction rate of flavonoids

由图4可知，提取率随乙醇用量的增加而增加，在乙醇用量为银杏叶量的12倍时总黄酮的提取率达到较高水平，再增加溶剂用量提取率增幅较小。

2.8 最佳提取条件的确定

在超声条件下提取银杏叶中黄酮类化合物，影响提取率的因素很多，为确定最佳提取条件，以总黄酮的提取率和含量为测定指标，在乙醇浓度为30%条件下，设计四因素三水平正交试验，考察超声功率、超声时间、溶剂用量和提取次数对银杏黄酮提取率的影响。实验因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Levels of the factors in orthogonal tests

依据上述因素和水平设计正交实验L9（34），进行提取实验，测量提取液中总黄酮的提取率。结果见表2。

对实验结果进行极差分析，根据极差大小判断各因素的影响。结果表明，四个因素中对总黄酮提取率影响的大小次序：提取次数＞超声波功率＞溶剂用量＞超声时间，即用30%的乙醇作为提取剂，超声功率为100%、超声时间为45 min、溶剂用量为银杏叶用量的12倍、提取次数为2次。在此条件下提取银杏叶中黄酮类化合物，总黄酮的提取率可达1.20%。

表2 正交试验结果分析表Tab.2 The results analysis of the orthogonal tests

比较两种方法发现，常规溶剂提取银杏叶的方法，无论是溶剂浓度、提取时间，还是溶剂用量均要求较高，且提取率、含量均较低，说明采用超声法提取银杏叶，可以大量节省时间，降低成本，且能够得到较高的提取率，充分体现了超声法提取银杏叶的优点：省时、省溶剂、高效率。

3 讨论

通过实验表明，在超声波条件下用乙醇作为溶剂提取银杏叶中有效成分的最佳工艺条件为：超声功率100%、超声时间45 min、溶剂浓度30%、溶剂用量为银杏叶用量的12倍，在此条件下提取2次，银杏叶中黄酮类化合物的提取率可达到1.20%以上。与传统的溶剂法相比，溶剂浓度、固液比、提取时间大大降低，而提取率显著提高，提取率是常规溶剂法提取率的1.5倍以上。因此，超声波用于银杏叶提取具有成本低、时间短、回收率高、有机溶剂残留少等优点。

[1]李艳丽,黄强,班春兰,等.从银杏叶中提取银杏黄酮的研究[J].精细与专用化学品,2006,14(34):20-22.

[2]韩玉谦,隋晓.银杏叶中活性成分萃取工艺的研究[J].精细化工,2000,17(9):505-506.

[3]张玉祥,李宗伟.银杏叶有效成分的提取工艺进展[J].时珍国医国药,2006,17(6):1076-1077.

[4]董嘉德.超声波在中药提取中的应用[J].中国药业,2002,11(11):55.

[5]范莹莹,黄小凤.乙醇-水体系中黄酮类化合物的浸取工艺研究[J].昆明理工大学学报,2006,31(2):104-106.

[6]张玉祥,邱蔚芬.银杏叶超声波提取工艺研究[J].时珍国医国药,2006,17(5):784-785.

[7]龙春,高志强,宋仲容,等.银杏叶中有效成分的微波提取及抗氧化活性研究[J].云南大学学报,2006,28(S1):248-251.

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