茭白黑粉菌的分离鉴定研究

赵海伟 邹克琴 叶子弘 尤文雨

（中国计量学院生命科学学院，浙江 杭州 310018）

茭白（Zizania latifolia（Griseb.））又名菰，是我国南方的一种水生蔬菜[1]。在太湖一带的浙江和江苏有大量栽种。在自然界中菰黑粉菌（Ustilago esculenta P.Hennings）属于其内生真菌，其与茭白共生，主要分布在茭白茎中[2]。菰黑粉菌生活在茭白茎中，抑制茭白开花结实，刺激茭白茎部膨大，茭白膨大的茎部可供食用[3，4]。关于茭白孕茭的生理变化国内有报道[5]，但是茭白和黑粉菌如何互作调节其茎部的发育的分子机制仍然不清楚。本文通过分离灰茭中的黑粉菌并进行鉴定研究，为探索茭白茎发育的调控机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

“余茭4号”灰茭，于2007年11月采自浙江省农业科学院。

1.2 试剂

Taq酶，dNTP均购自博日科技有限公司；pMD18-T Vector购自大连宝生物公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和大肠杆菌DH5α均购自天根生化科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 菰黑粉菌的分离和培养

将“余茭4号”灰茭用流水冲洗，再用蒸馏水洗净晾干，在超净工作台上用75%酒精擦拭表面，用无菌小刀横向切开，用接种环挑取黑色的孢子于1mL无菌水中混匀，取50μL涂布于PDA固体培养基中，28℃培养。

1.3.2 黑粉菌的鉴定

1.3.2.1 形态鉴定

待PDA固体培养基中长出单菌落后，肉眼观察菌落形态，同时用牙签沾取单菌落置于无菌水中，取10μL菌液显微镜下观察。

1.3.2.2 菰黑粉菌的分子鉴定

(1)黑粉菌总DNA的提取

挑取单菌落接种于PDA液体培养基中，在摇床中以130r/min，28℃恒温震荡培养。第7天取培养液20mL，8000r/min室温离心2mins，取菌体，参照吴志红等[6]方法提取菌株基因组DNA。

(2)ITS-5.8S rDNA-序列的PCR扩增

应用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增其ITS5.8S rDNA。上游引物ITS1序列为：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，下游引物ITS4序列为：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs Mixtur 4μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μl，DNA template 1μL，Taq 酶 1μL，加 ddH2O到50μL。PCR 反应条件为 94℃ 5 min，94℃30s，50℃ 30s，72℃ 1min，30 个循环，72 ℃延伸10min。

(3)琼脂糖凝胶电泳

取3μl PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶孔内进行电泳,用凝胶成像分析系统观察并照相。

(4)克隆测序及序列分析 用DNA回收试剂盒回收纯化目的DNA。将目的基因与pMD18-T载体连接,连接产物转化感受态细菌DH5α，在37℃培养12-14h后，用蓝白斑筛选的方法,挑取白色单菌落,PCR鉴定该单菌落确实含有目的基因后,将菌液送至上海英骏生物技术有限公司进行序列测序，测序结果在NCBI数据库中BLAST，并进行同源性比较。

2 结果

2.1 菰黑粉菌菌体形态观察

在PDA固体培养基中培养3天后，菌株形成单菌落，背面和正面均为白色，大小1-3 mm，。培养7-10后，单菌落逐渐变大，形状为不规则圆形，波状，中间隆起或有脊状突起，单菌落颜色由白色逐渐变黄，且随培养时间的延长而加深（图1）。

图1 黑粉菌在平板上的形态

图2 菰黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列扩增图

M:DNA marker(从上到下大小：2000bp,1000bp,700bp,500bp,200bp,100bp)Lane1-2:菰黑粉菌PCR

2.2 PCR扩增结果

取3μl PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶孔内进行电泳。扩增片段大小为775bp，结果见图2。

2.3 黑粉菌5.8SrRNA的分子进化树分析

“余茭4号”灰茭黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列经测定后提交至GenBank，登录号为FJ527029。根据ITS-5.8SrRNA序列，构建菰黑粉菌（FJ527029）和黑粉菌属其他31个不同种发育树，见图3。从发育树上可以看到有5个明显的类群（图中竖线），而分离出的黑粉菌（Ustilago esculenta）是黑粉菌属的边缘物种。

图3 ITS5.8SrRNA序列的黑粉菌属发育树

3 讨论

真菌的鉴定主要从真菌的孢子形态、菌落特征、生理生化特征等方面进行。按照这种传统的方法鉴定真菌需要较长的时间和繁琐的生化鉴定过程。随着分子生物学鉴定手段运用到真菌的分类鉴定中，真菌5.8S rDNAITS区域是一段稳定、保守而又具有种间特异性的基因区域，可以针对该区域设计特异性引物进行真菌的分子鉴定。本研究结合菌落形态和分子生物学手段对菰黑粉菌进行了成功鉴定。采用真菌通用引物ITS1和ITS4成功扩增了菰黑粉菌的ITS-5.8S rDNA区段，所测序列与NBCI上公布的菰黑粉菌同源性达到100%。

[1].陈守良,徐克学.菰属 Zizania L.植物的分支分类研究[J].植物研究,1994,14(4）:385-394.

[2].柯卫东，孔庆东.茭白肉质茎形成的初步研究[J].长江蔬菜，1996，（12）：23.

[3].Chan,Y.S.and Thrower,L.B.,The host parasite relationship between Zizania caduciflora Turcz.and Ustilago esculenta P[J].Henn New Phytol,1980,85:201-233.

[4].韩秀芹.茭白黑粉菌生物学特性的研究[M].2004,扬州大学硕士学位论文.

[5].张聂，寿森炎.茭白孕茭的生理变化研究[J].浙江农业科学,2006,6:613-617.

[6].吴志红,汪天虹,黄卫.简便易行的丝状真菌染色体DNA提取法[J].菌物系统；2001,11(2):38-39