一株虫草类真菌的液体发酵产胞内多糖培养基的优化*

福建师范大学生命科学学院 柯 轶 巫文政 毛 宁

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)的虫生真菌[1]。自古以来冬虫夏草就为广大人们所熟知的具有保健作用的食用菌。冬虫夏草主要含有核苷类化合物、氨基酸、多糖类、甘露醇等成分，多糖是冬虫夏草所含的有效生理活性物质中最重要最丰富的种群之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗辐射、降血糖、降血脂等生物学活性[2]。多糖是当今新药开发的重要方向之一，是冬虫夏草开发研究的一个重要突破口。

天然虫草自然寄生率低，生长条件苛刻，加上人们的滥采，导致天然资源紧缺。天然虫草已远远不能满足日益增长的市场需求，而且天然虫草目前市场价格昂贵，已高达每公斤3～4万元。研究表明采用人工液体发酵的虫草菌丝的有效成分含量与天然虫草几乎相当[3]，并且液体发酵法能在短时间内生产大量的菌丝体，因此人工发酵虫草将是生产虫草产品的重要手段，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

虫草真菌Fc-001 （Cordyceps fungi Fc-001），福建师范大学菌保藏中心保藏

1.1.2 试剂

玉米粉，玉米淀粉，早米粉，白糖，葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，奶粉，黄豆粉，花生粉，酵母膏，玉米浆，牛肉膏，均为市售。

MgSO4·7H2O，KH2PO4，三氯甲烷，正丁醇，乙醇，苯酚，硫酸，均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

DELTA 320PH计，SHK-99-Ⅱ型台式恒温摇床，SONICS超声波破碎仪，HH-4型恒温水浴锅，日立CR21G高速离心机，721分光光度计。

1.1.4 培养基

斜面培养基:PDA

种子培养基（%）: 葡萄糖2，酵母粉1，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，灭菌30min。

发酵基础培养基（%）:玉米淀粉4，酵母粉2，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

种子液培养:将活化的斜面菌种接种于种子培养基中，24℃、180r/min振荡培养3d。

发酵培养:将培养好的液体种子按5%(V／V)的移种量接种到发酵培养基中，24℃，180r/min振荡培养7d。每个因素做两个重复。

1.2.2 多糖提取

发酵产物通过过滤分离菌丝体并用蒸馏水洗3遍，将菌丝体干燥至恒重。干菌丝研磨，过200目筛后称取0.4g菌丝体粉末溶于50mL蒸馏水中，置超声波破碎8min，90℃水浴2h后定容至50mL，并离心得到上清液，用sevag法除蛋白[4]，将pH调至7.0，吸取10mL置于4℃醇析12h[5]，离心得到多糖沉淀并用40mL蒸馏水复溶。

1.2.3 多糖测定

1.2.3.1 测定方法

采用苯酚-硫酸法测定[6-7]。

1.2.3.2 测定标准曲线

配制50 μg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL用蒸馏水补充至2.0mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混匀，立即滴加浓硫酸5mL，摇匀，60℃水浴15 min，然后置冷水中冷却15min，在490nm波长处比色。

1.2.3.3 样品多糖测定

取样品溶液0.2 mL用蒸馏水补充至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，立即滴加浓硫酸5mL，摇匀，60℃水浴15min，然后置冷水中冷却15min，在490nm波长处比色。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程建立

用紫外分光光度计，在490nm的波长处比色，以试剂空白做参比，实验结果见图 1。

所得其线性回归方程式y = 0.0068x + 0.0002，相关系数R=0.9998。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 不同碳源对多糖产量的影响

以4%的玉米粉、玉米淀粉、早米粉、白糖、葡萄糖为碳源的发酵基础培养基（去除玉米淀粉）培养虫草菌丝体，24℃，180r/min振荡培养7d，研究其对虫草产胞内多糖的影响。结果见表1。由表1可以看出，以上述成分作为碳源的时候，对生物量的影响排序依次是:玉米粉＞早米粉＞玉米淀粉＞白糖＞葡萄糖，对虫草胞内多糖产量的影响排序依次是:玉米淀粉＞玉米粉＞早米粉＞白糖＞葡萄糖。综合考虑生物量，胞内多糖含量等因素，最终决定以玉米淀粉作为碳源。

表1 不同碳源对冬虫夏草胞内多糖产量的影响

2.3 不同氮源对多糖产量的影响

以 2%的酵母粉、蛋白胨、奶粉、黄豆粉、花生粉为氮源的发酵基础培养基（去除酵母粉）培养虫草菌丝体，24℃，180r/min振荡培养7d，研究其对冬虫夏草产胞内多糖的影响。结果见表2。由表2可以看出，以上述成分作为氮源时，花生粉作为氮源所获得虫草菌丝产量最高，酵母粉次之；酵母粉作为氮源发酵的菌丝中胞内多糖含量明显高于其他氮源。胞内多糖总量依次为:酵母粉＞黄豆粉＞奶粉＞花生粉＞蛋白胨。综合生物量及虫草胞内多糖产量因素，选择酵母粉为最佳氮源。

表2 不同氮源对冬虫夏草胞内多糖产量的影响

2.4 不同生物素对多糖产量的影响

发酵基础培养基（去除酵母膏）分别由0.5%的酵母膏、玉米浆、牛肉膏作为生物素提供生长因子，不加生物素为空白对照，24℃，180r/min振荡培养7d，研究其对冬虫夏草胞内多糖的影响。结果见表3。由表3可以看出，酵母膏、玉米浆、牛肉膏都对虫草菌丝体生长有促进作用，但以玉米浆、牛肉膏为生长因子时，虫草菌丝胞内多糖总量都少于空白对照，只有酵母膏对虫草胞内多糖产量有促进作用。故选用酵母膏为最适生物素。

表3 不同生物素对冬虫夏草胞内多糖产量的影响

2.5 不同pH对多糖产量的影响

将基础发酵培养基的起始pH值调节至5、6、7、8，24℃，180r/min振荡培养7d。结果见表4。由表4可以看出，起始pH 5.0的条件下获得虫草菌丝产量最高，但其胞内多糖含量较低。虫草菌丝体的量随起始pH的增大而降低，单位质量的菌丝中胞内多糖含量随起始pH的增大而增大。综合生物量及虫草胞内多糖含量考虑，起始pH 7.0条件下能获得较多的菌丝和最多的胞内多糖。

表4 不同的起始pH值对冬虫夏草胞内多糖产量的影响

2.6 正交试验

根据单因素试验结果，以玉米淀粉，酵母粉，酵母膏，pH 进行四因子三水平正交优化。正交试验因素水平及结果见表5和表6，方差分析见表7[8-9]。

表5 正交试验因素和水平表

表6 正交试验结果直观分析表

表7 方差分析表

正交试验结果表明，影响虫草产胞内多糖的因素依次为玉米淀粉，酵母粉，pH，酵母膏。方差分析结果表明，玉米淀粉和酵母粉对虫草产多糖有极显著作用，而酵母膏水平的改变和pH的改变无显著作用，对多糖的产量影响不显著。因此培养基中只需添加酵母膏0.1%，pH可以选择在6.5～7.5之间。最终确定虫草产胞内多糖最适培养基为:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

3 结论与讨论

虫草多糖是虫草的主要活性物质之一，它具有能调节免疫系统作用，抗氧化，抗衰老，抗肿瘤，抗炎等多种活性作用，是当今医药研究新的重点方向之一。但虫草具有生长周期长，栽培困难等问题，因此，通过对其无性菌丝体进行液体发酵从而获得活性产物，可以比较容易地获得所需活性物质，且缩短其生长周期，更有利于工业化生产。

在液体发酵培养中，根据所需的产物的不同，如:菌体，胞内多糖，胞外多糖等等，培养基的配方也不大相同。本实验先对虫草产胞内多糖液体培养基条件进行单因素的筛选，试验结果表明，玉米淀粉为最佳碳源，酵母粉为最佳氮源，酵母膏为最佳生物素，最适的pH为7.0，然后对其进行正交试验，进一步确定虫草产胞内多糖最适配培养基为:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

同时，实验结果也表明，最适合虫草菌丝体生长的碳源是玉米粉，氮源是花生粉，生物素源是酵母膏，pH为5.0。因此，寻求一种既能提高虫草菌丝体，同时又能增高虫草胞内多糖含量的培养基配方，成为进一步研究的方向。

[1]邢来君,李明春. 普通真菌学[M].北京:高等教育出版社,1999.

[2]王蓉,吴剑波. 多糖生物活性的研究进展[J].国外医药抗生素分册, 2001,22(3):97-100.

[3]梁淑娃,方展瑞,等. 冬虫夏草菌丝体深层发酵技术的研究[J].广东食品工业科技, 2000, 16(1):25-27.

[4]Staub A N.Removal of proteins from polysaccharides[J].Method Carbonhydr Chem, 1975, 5: 5-6.

[5]余晓斌,罗长才, 缪静. 冬虫夏草多糖提取工艺的优化[J]. 中草药, 2002,33(12):1086-1087.

[6]罗毅,潘细贵, 刘刚, 李运飞. 苯酚—硫酸法测定多糖含量显色方式的优选[J].中国中医药信息杂志,2005, 12(1):45-46.

[7]鲁晓岩.苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J]. 食品工业科技,2002,23(4):69-70.

[8]正交试验设计法[M]. 上海:上海科学技术出版社, 1979.

[9]胡亮,杨大锦. Excel与化学化工试验数据处理[M].北京:化学工业出版社,2004.