骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞的研究进展

2010-07-24王珊珊徐国兴

海峡科学 2010年5期

王珊珊徐国兴

王珊珊1.2徐国兴1

1.福建医科大学第一临床医学院 2.福建卫生职业技术学院

视网膜色素变性及老年性黄斑变性是严重威胁视力的疾病，目前临床上缺乏有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 有跨胚层分化能力，在一定的条件下可以向神经细胞分化。大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成为视网膜色素细胞的研究为此类疾病的治疗带来了希望，成为近年来该领域的研究热点。本文对近年来不同培养条件对大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化的影响以及视网膜前体细胞眼内移植的进展综述如下。

1 BMSCs体外诱导实验

BMSCs向某一特定细胞的分化，必须依靠相应微环境所提供的各种营养因子来完成。原始视网膜发育的微环境是最适宜的微环境，这种微环境提供了BMSCs定向诱导分化所具备的各种生长因子以及营养成分。人工诱导分化干细胞的方法，就是对这种微环境的模拟。模拟的准确性越高，分化效率也就越高。

1.1 单用诱导介质

1.1.1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)诱导方法是诱导BMSCs向神经元方向分化的经典方法，其优点是可以获得较多的神经元样细胞，分化的阳性率为78%。刘东宁等[1]用bFGF诱导后结果与Woodbury一致。用bFGF诱导后细胞GFAP表达阴性，认为主要是向成熟神经元方向分化，而不是神经胶质细胞。诱导后从形态学上在细胞间建立了突触联系，但诱导后细胞难以长期存活，需联合其他神经营养因子进行维持培养，才利于长期存活。在培养中，刘东宁等用含10 ng/mL bFGF进行接触性的诱导，有报道是用20 ng/mL bFGF进行接触性的诱导。

1.1.2乳鼠视网膜细胞：采用新出生1~3天的乳鼠视网膜细胞作为诱导剂。有学者把将视网膜神经细胞培养换液的上清液收集于干净玻璃瓶中，真空抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合后备用。用上述混合液进行BMSC细胞的诱导分化，倒置相差显微镜下观察细胞的生长及分化情况。徐春玲等[2]是将新出生1~3天的乳鼠视网膜细胞置于Transwell双层培养板的上层，这些尚未成熟的视网膜组织内尚存在一些促进原始视网膜干细胞分化和发育的细胞因子及细胞外基质成分，可通过上层的滤膜孔扩散至下层的BMSCs周围，而上层的乳鼠视网膜细胞却无法滤过到BMSCs周围，从而模拟了原始视网膜发育的微环境。BMSCs在此微环境中，分化为具有神经细胞形态特征的神经样细胞。实验组诱导3d后，检测到RGCs标志物Nestin阳性细胞的表达，比率为30.9%±7.7%，但7d后表达减弱(23%±4%)。

1.1.3 activin A、牛磺酸和表皮生长因子（EGF）：Anthony等[3]应用activin A、牛磺酸和EGF体外诱导分化后，发现有20%～32%的细胞在体外可表达感光细胞特异标志——视紫红质、视蛋白和recoverin。将MSC植入RCS大鼠视网膜下腔内，移植入视网膜下腔的MSC未表达细胞增殖的标志，说明MSC在移植入视网膜下腔后经历的是分化的过程而非增殖。这与Kicic A实验的结果一致。

还有，Woodbury等利用BME、DOSO、BHA为诱导剂将BMSCs诱导成为神经样细胞。还有人利用中药，如人参、丹参、当归、黄芪等诱导BMSCs为神经样细胞。

2 借用支架培养

2.1 三维支架的选择

三维支架培养是组织工程中最典型的培养方式，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞连接，而且为细胞提供特异性的生长和分化信号，形成与体内相似的细胞生长微环境，引导组织形成。近年来，BMSCs的三维培养已用于骨、软骨、肌腱和脂肪等组织的工程研究，其主要的支架材料为明胶海绵、水凝胶、β-磷酸三钙及聚己内酯等。但应用在神经元细胞上未见相关报道。

羊膜(human amniotic membrane，HAM)基质：王晶等[4]采用人的HAM基质负载BMSCs定向诱导分化为神经元样细胞。在实验中，观察到BMSCs接种到HAM基质上后能很快贴附生长，细胞活力好，折光性强，第3-10天可在HAM基质面密集生长，这与张妍等报道相同。王晶等则认为，把HAM基质作为细胞培养载体具有以下的优点：HAM基质主要成分为胶原纤维和网状纤维，其三维支架结构为神经元样细胞及其轴突的生长提供了广阔的空间；HAM基质免疫原性低，具有良好的生物相容性和抗炎性；HAM基质内的EGF、bFGF等多种生长因子为细胞的增生和分化提供了丰富的营养成分，HAM内可能产生的某种未知的有很强神经保护作用的因子，为神经元样细胞及其轴突的生长提供了更多的营养支持。

2.2 三维支架的诱导剂

王晶等[4]以HAM基质作为载体，以新出生1～3 d的乳鼠视网膜细胞作为诱导剂进行非接触培养。以HAM基质为载体，以2-巯基乙醇（DMEM/F12）接触培养将其诱导定向分化成神经样细胞。关于二种实验方法的效果比较未见相关报道。也未见借用HAM基质作为载体和单用乳鼠视网膜细胞作为诱导剂这二种诱导方式效果比较的相关报道。

3 BMSCs体内移植实验

BMSCs移植入体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的问题。近年来，主要运用的标记物有以下几种。

3.1 超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)。SPIO是研究发现的新型磁共振阴性对比剂，可在活体标记神经干细胞。Frank等研究发现SPIO颗粒与转染试剂结合后标记干细胞比使用单纯SPIO颗粒高100倍。陈舒泽等[5]研究发现，SPIO的浓度对此有至关重要的影响：浓度过低无法达到较高的标记效率满足MR的需要。在标记浓度为11.2mg/L左右时，既能达到较高的标记效率，又不影响视网膜前体细胞的体外生长增殖，但这与有些文献报道不同。转染剂结合SPIO并无短期或长期毒性作用。

3.2 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)。BrdU是胸腺嘧啶类似物，移植的细胞与含有BrdU的培养基一起孵育，让它取代胸腺嘧啶而掺入处于DNA合成期细胞的DNA中作为标记，用免疫荧光或免疫组织化学显示移植的细胞。BrdU作为标记应选择适当的浓度，采用质量浓度为10μg/mL的BrdU标记的了BMSCs与未做标记的细胞生长情况基本相同，在荧光显微镜下可见BrdU标记的MSCs细胞核被染色，未做标记的细胞不着色。

3.3 细胞荧光黄(LY)。显微镜下选取诱导后1 d形态和活性良好的细胞，将细胞爬片置于灌流槽中。电极拉制器拉制玻璃毛细管微电极，注入电极液后电阻范围为8～12mΩ。调节微操纵器，使电极尖端接近细胞，利用特定的测试方波电脉冲形成封接，在电极尖端接触细胞表面之前，向微电极加正压。当接近细胞时，给予短暂负压吸引。当电极尖端与细胞膜表面形成1～5 gΩ封接电阻时，用力吸破电极尖端上的膜片，LY通过记录电极尖端扩散入所记录的细胞内，5～10min后，在Leica荧光显微镜下观察细胞形态并拍片。

3.4 视网膜电图。视网膜电图是客观有效地反映视网膜功能变化的一个敏感指标，b波反映了视网膜内核层区域细胞的电活动，是视网膜缺血的敏感指标。用视网膜电图、b波观察骨髓间充质干细胞视网膜下移植对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响。

3.5 荧光染料。4，6-二脒222苯基吲哚(DAPI)是一种蓝色荧光染料，可被不同时期的细胞摄取并与DNA结合。把(DAP I)储存液(Sigma)加入第2代BMSCs培养液中，至终浓度为50mg/L，37℃孵育染色1 h，Hanks平衡液冲洗6遍，消化、离心收集细胞，重悬于PBS中(106个/mL)，置于冰上待用，然后采用标记细胞直接在荧光显微镜下识别，阳性率达100%。神经节细胞密度与内层视网膜厚度是检测视网膜损伤修复程度的常用指标。用苏木精-伊红染色研究内核层细胞结构和排列情况，用尼氏染色是对视网膜神经节细胞进行定量研究。还有用绿色荧光染料(PKH-67)标记了BMSCs进行实验。

4 动物模型与结果

4.1 正常模型

张枝桥等[6]把MSCs移植到同种异体成年大鼠视网膜下腔后14 d，主要分布于RPE层和视锥、视杆细胞层，证明MSCs能够在视网膜下腔存活并能与原视网膜结构相融合；免疫荧光结果显示，移植后的MSCs细胞并未表达光感受器细胞的特异性抗原Rhodopsin。对于这一阴性结果，认为原因可能有以下两点：一是由于实验条件所限，观察时间太短，移植后的BMSCs可能还来不及发生分化，这一点可在下一步的实验中通过延长观察时间来证实。二是本实验选用的受体为正常的成年大鼠，正常成年大鼠的视网膜与新生大鼠视网膜及非健康的大鼠视网膜相比，后者的微环境更有利于移植细胞的迁移、整合、分化，在这一微环境中起主要作用的可能是一些生长因子，如bFGF、NGF、GDNF、BDNF和CNTF等。而在正常成年大鼠的视网膜中，这些生长因子的水平相对较低，对移植细胞产生的趋化作用较弱，不利于移植细胞的整合、分化。大鼠MSCs移植于正常和Nd:YAG激光损伤后的大鼠视网膜下5周，MSCs可与原视网膜结构相融合分布于RPE层、视细胞层、双极细胞层及节细胞层，ERG检测表明损伤移植组的b波水平高于对照组。

4.2 损伤模型

光损伤模型：张钰等[7]光损伤模型的制作：除N组外的SD大鼠经过24 h暗适应，被放入光损伤仪中(北京大学医学部仪器厂制作)光照24 h，光照强度为(950±50)lx，波长为480～520 nm，光照后置于黑暗中3 d，此后恢复到正常光环境，并在视网膜下移植BMSCs，研究结果发现，BMSCs可能是通过其分泌的细胞因子bFGF发挥其营养支持作用，从而对光感受器细胞产生保护作用，抑制了光损伤大鼠光感受器细胞的凋亡，但BMSC并没有整合到大鼠视网膜组织中起替代作用。

注射3%NaIO3损伤RPE模型：在Lewis大鼠腹腔注射3%NaIO3(100mg/kg)建立大鼠RP模型，将体外培养的BMSCs植入视网膜下腔，术后第1周即可见BMSCs主要分布于RPE层和视锥、视杆细胞层，并从第3周开始表达RPE细胞及光感受器细胞的表面标志，但尚未需从功能上进行验证。龚莉华等[8]用同一方法研究发现，诱导后的细胞表达RPE细胞、光感受器细胞和星形胶质细胞的特异性标志，但没有整合入神经视网膜层，也没有证据支持其分化为光感受器细胞。

视网膜缺血再灌注动物模型：用血管结扎法建立视网膜缺血再灌注损伤模型。即是分离、暴露视神经，在其根部用3/0涤纶线打活结，60 min后拆除结扎线，恢复血流。缺血再灌注损伤后28 d后视网膜下移植骨髓间充质干细胞组与非移植组相比，移植组视网膜电图b波增高，组织结构破坏不显著，内层视网膜厚度显著增厚，研究认为骨髓间充质干细胞对视网膜缺血再灌注损伤有神经保护作用，且该作用与骨髓间充质干细胞移植有关，而与磷酸盐缓冲液无关。王陆飞等[9]眼缺血再灌注损伤的实验模型是在右眼角巩膜缘穿刺，注入BSS平衡盐溶液，用间接检眼镜观察，当眼内压上升到80 mmHg维持约60 min时，间接检眼镜下可见视网膜血管阻塞，视网膜变白，也可发现虹膜变白，此时终止眼内灌注。以间接检眼镜确定血管再充盈后，用Br2dU标记的BMSCs进行视网膜下移植。然后做了BrdU阳性细胞连续切片的免疫组化染色，发现BMSCs在视网膜下移植后有一部分参与了视网膜的重建，一部分参与了损伤的增生，还有一部分形成了新的节细胞层增生。BMSCs的参与可以缓解缺血对视网膜神经节细胞的损伤，具有向损伤部位迁移的能力。证明了BMSCs能够在视网膜下存活并能与原视网膜结构相融合，初步判断形成的视网膜样结构具有神经细胞特性，但尚不能确定这种新形成结构是否能够建立一定的神经传导。

5 鉴定

鉴定指标有以下几种：(1)Nestin：为神经巢蛋白，是神经上皮干细胞蛋白，属于中间丝蛋白，只在多潜能的神经外胚层细胞中表达，是神经干细胞特有的生物学标记。(2)生长相关蛋白(GAP-43)：是一种细胞骨架蛋白，特异性地分布于神经元胞体及突起中，是轴突成熟的标志之一，国际上将GAP-43列为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子标志物。(3)神经丝(Neurofilament，NF)：属于中间丝家族的第Ⅳ型，广泛分布于成熟神经元中。(4)视网膜神经节细胞的特异性标志物Thy111检测。但大部分的学者只用其中一种或几种：王晶等[4]用免疫组织化学方法测定分化所得细胞的Nestin、NF表达；或应用免疫组织化学方法检测神经上皮干细胞蛋白Nestin、神经元特异性标记物GAP-43的表达；刘东宁等[1]则检测Thy111表达。