骨髓间充质干细胞在视网膜疾病研究中的应用

徐 巍 郭 健 徐国兴

骨髓间充质干细胞在视网膜疾病研究中的应用

徐 巍 郭 健 徐国兴

福建医科大学附属第一医院，福建省眼科研究所

视网膜疾病是眼科疾病研究中的难点，也是致盲的重要原因。多种原因引起的视网膜疾病的共同结果是光感受器细胞或神经节细胞的变性坏死。当前对坏死的视神经细胞缺乏有效治疗措施。因此，利用干细胞，尤其是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞（Marrow Mesenchymal Stem Cells, MSCs），诱导分化成为视网膜细胞；恢复和重建视网膜的结构和功能有望成为视网膜疾病治疗的新途径。

骨髓间充质干细胞 可塑性 视网膜

视网膜是由视网膜色素上皮层和神经感觉层组成的对光敏感且精细的膜样结构，是视觉形成的基础。任何原因引起的视网膜血管，神经感觉组织和色素上皮的病变均可导致视力损伤，甚至致盲。各种原因引起的视网膜疾病的最终结果都是视网膜神经细胞的坏死或凋亡，造成不可逆的损伤，如：视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）等。虽然目前有多种治疗方法，但疗效均欠佳。随着干细胞研究的深入，利用干细胞，尤其是MSCs，诱导分化为视网膜各种细胞，恢复视网膜的结构和功能可能有望成为新的治疗途径。

干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有分化的全能性，可分化成为各种类型的细胞[1]。利用胚胎干细胞移植入受损部位可使组织再生恢复功能。已有报道指出胚胎干细胞可以向视网膜前体细胞诱导分化[2]。胚胎干细胞对于视网膜变性疾病的治疗有很大潜力，但是由于胚胎干细胞的研究在伦理方面存在很大争议。此外，胚胎干细胞的MHC-Ⅰ类分子随细胞分化而不断增加，使其排斥反应成为限制其应用的一个重要问题。成体干细胞是存在于个体组织中的具有多向或单向分化的潜能，广泛存在于骨髓、肝脏、心肌、脑、及视网膜等组织中。在特定情况下，如组织损伤等，可增殖分化修复受损的组织。各种成体干细胞中，以MSCs具有多向分化潜能，可分化成为包括骨、软骨、脂肪细胞、筋膜、肌肉及骨髓基质等[3]，而成为当前研究的热点。此外，MSCs克服了胚胎干细胞的缺点，来源丰富，取材方便，易于分离纯化，可塑性强且不存在伦理学问题。

1 MSCs概述

1867年Cohnheim在研究损伤修复时，利用可溶性苯胺染料经静脉注射后发现染料出现在远端受损修复部位的细胞中。并由此推测损伤部位的细胞是来自血液的，而且很可能来自骨髓。虽然这一推断至今尚未得到证实，但是最近的研究证实骨髓中确实存在一种不同于造血干细胞且具有多向分化潜能的干细胞，即MSCs。

1.1 MSCs的细胞学特点

MSCs除具有细胞核浆比值大，细胞器少等干细胞的一般形态学特点外，还有细胞呈梭形，粘附能力强，每2~4个细胞可形成一个集落单元[4]。MSCs分裂周期在33h左右，具有较强的分裂能力。体外培养的MSCs经过20~30次的细胞倍增后，应用带微孔的胶囊将其包绕并植入鼠的腹膜，可发现MSCs仍可分化成为纤维、骨、软骨等组织[5]。

1.2 MSCs的免疫标志物

利用流式细胞仪分析显示，MSCs大多数可表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。MSCs不表达造血干细胞的标志物，包括脂多糖受体CD14、CD34以及白细胞的一般标志物CD45[3]。所以目前认为可以把CD44、CD105、CD106等骨髓细胞标志物阳性等作为MSCs免疫学鉴定方法。

1.3 MSCs诱导分化的分子因素

作为间质来源的干细胞，MSCs具有多向分化潜能且分化的方向视诱导因素的不同而各异。MSCs分化过程中涉及多种细胞因子。各种细胞因子的作用方式和信号传导过程也不同。其中，受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）可从细胞的增殖、生长、分化等方面调控细胞。过程包括配体—受体的结合，受体磷酸化并活化下游分子，通过级联反应对细胞生长分化等发挥重要作用[6]。影响MSCs生长分化的蛋白质分子包括多种生长因子分子，如BMP,activin等，和多种类型的白介素。这些分子通过不同时相和浓度作用于MSCs，使其生长并向多种细胞类型分化。Irina Kratchmarova等[6]，在研究多种细胞因子对MSCs对分化的作用机制时，发现hMSCs分化成为骨样细胞是表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）刺激产生的，而不是血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）。多数细胞内信号传导蛋白可同时传导两种配体的刺激信号，但是磷酯酰肌醇激酶３（PI3K）途径却是单独由PDGF激活的。利用PI3K的抑制剂可以使PDGF诱导分化的效应回退。这表明该途径可能是一个细胞分化的控制点。此外，Runx2与PPARγ是调节MSCs分化的的两个关键转录因子，通过以上两个转录因子的活化分别驱动MSCs分化成为骨母细胞或脂肪细胞。同时，14-3-3结合蛋白TAZ对Rux2与PPARγ依赖性基因有分别共同激活和抑制的作用。MSCs的分化分子机制复杂，对其进行全面的研究有助于成功诱导MSCs分化成为目的细胞。

2 MSCs在视网膜疾病研究中的应用

多种试验已证实MSCs可以分化成为包括视网膜的各种细胞在内的多种类型组织细胞或前体细胞。由于视网膜是由RPE、光感受器细胞和神经节细胞等组成。RPE和神经感觉层的细胞分别由胚胎发育时的神经外胚叶的外层和内层发育而来，各种细胞高度分化。因此，要实现将MSCs成功诱导分化成为视网膜细胞就需要不同的诱导条件。当前对于MSCs在视网膜疾病研究中的应用，大体是通过两条途径来实现的，即体外培养诱导和眼内移植。两条途径各有优缺点。利用体外诱导可以通过人工添加各种生长因子等，明确各种蛋白质分子对MSCs诱导的作用。培养液中成分明确便于分析，但是在尚未明确MSCs分化成为视网膜细胞的机制之前，体外培养无法准确诱导MSCs分成特定类型的细胞或前体细胞；成功诱导较为困难。与体外培养相反MSCs移植则可以应用体内适于MSCs分化的微环境诱导其分化成为特定类型的细胞或前体细胞。甚至某些分化的细胞可具有部分功能。但是眼内移植同样存在缺点。如体内微环境复杂，存在多种促进或抑制分化的因素。此外，复杂的体内环境对于MSCs诱导因素的分析同样是存在困难的。

2.1 细胞标志物的检测

检测MSCs是否被诱导成为目的细胞需要一定的检测指标。而在细胞类型的检测中，免疫标志物是较为可靠的指标，且在成为功能细胞前即可出现。几种视网膜细胞具有各自的标志物，RPE，可表达角蛋白、RPE65等，光感受器细胞表达视紫红质、视蛋白等。神经节前体细胞则可表达巢蛋白。神经胶质细胞可表达胶质酸性纤维蛋白等。所以当前对于MSCs诱导分化成为视网膜各细胞的研究也多采用这些标志物作为初步检测指标。而在功能检测方面，RPE常检测其是否形成色素或类似色素的颗粒。神经细胞则应用到电生理，如膜片钳等技术等；或是检测是否存在突触囊泡等。

2.2 MSCs诱导成为视网膜各细胞的关键

由于视网膜各种细胞高度分化，故利用MSCs诱导分化成为视网膜细胞需详尽了解诱导过程的关键因素。当前多数研究是将MSCs与特定细胞共培养并适当添加生长因子或利用体内微环境诱导。这些方法尚不能把诱导过程的关键因子一一阐明，但眼的发育过程为我们提供了可能与诱导过程存在密切关系的某些因子。

RPE的形成与TGFβ的超家族成员BMP和activin存在密切关系[7]，其中BMP对RPE的正确发育有重要作用。因为Noggin的过渡表达可导致区域特异性的RPE完整性缺损[8]。神经视网膜可由视杯的神经上皮发育而来或由RPE转分化形成，FGF家族成员的分子对分化的两条途径均有重要作用[9]。bFGF可使神经上皮向神经视网膜转换[10]，而胚鼠RPE中FGF9的表达则可使RPE向神经视网膜转变[11]。而在光感受器发育时两个重要的转录因子，视网膜链氨基酸拉链（Nlz）和核受体（Nrze3）可以调节视杆细胞特异性的转录，同时抑制视锥细胞相关的基因转录表达[12]。二者的同时缺失则可使视网膜前体细胞向视锥细胞分化[13]。

2.3 体外培养诱导MSCs向视网膜细胞分化

Urs Vossmerbaeumer等[14]利用RPE条件培养液培养MSCs，通过研究添加血管活性肠肽（VIP）是否可以调节MSCs的分化进程时发现MSCs可以表达RPE的某些特异性标志物，如：bestrophin,角蛋白8,18以及RPE65等；而且在进一步检测细胞功能时发现，利用促黑素（MSH）可以刺激已分化的MSCs表达色素颗粒，这些结果表明MSCs具有向神经外胚层分化的潜能，可以产生具有RPE特性的细胞表型且具有一定得功能。有学者利用鼠MSCs与不同发育时相的神经视网膜前体细胞（RPC）共培养时发现，与EB.5RPC共培养3d后的MSCs表现出神经元样外观，膜出现突起的结构。利用RT-PCR 和免疫荧光可检测到Pax6,Brn36和巢蛋白表达，如果将培养时间延长到7d或14d则无法检测到Pax6,Brn36的表达，而且在14d的培养后MSCs恢复原来的梭形外观，由此认为MSCs自身可能存在着反馈调节，可以再一定程度抑制其分化，以维持干细胞的特性。

CD90­­­­+的MSCs的可塑性已被多种实验证实,CD90+的MSCs可被包括牛磺酸、actinvin A、和EGF在内的多种介质诱导分化成为视网膜神经细胞样的细胞。被诱导的MSCs中30%可表达光感受器细胞的特异性标志物RHOS；同样也有30%的细胞可表达无长突细胞的标志物CRABP1。另外尚有少数细胞可被这三种介质诱导表达巢蛋白。

2.4 MSCs移植诱导分化成为视网细胞

多数MSCs体外移植治疗视网膜疾病研究的途径是利用分离培养的MSCs经视网膜下腔注射。有学者用GFP或BrdU标记CD90+的MSCs后注射入成年RCS鼠视网膜下腔。2W后发现CD90+的MSCs与宿主视网膜整合形成类似光感细胞层的结构，并且细胞可出现Opsin、RHOS、突触囊泡等，而分裂期细胞标志物PCNA并未测得。这表明细胞是进行了分化而不是分裂，这一结果证实MSCs可以分化成为视网膜细胞.该研究为视网膜变性病变的细胞疗法的研究提供了良好的前景和研究途径。

Wang.S等[15]利用RCS鼠的MSCs分别通过尾静脉和视网膜下腔途径对同基因鼠进行注射后，在不同时相进行光感细胞血管功能形态学方面的检查，发现视网膜下腔注射后可以很大程度上挽救视网膜的形态和功能，而经尾静脉注射则可对整个视网膜的光感细胞有挽救作用，两条途径结合则可以同时挽救光感细胞和视觉功能。

3 问题与展望

干细胞研究是当前的一个热点和难点。利用MSCs诱导分化成为视网膜细胞，可以为多种视网膜变性疾病带来希望，但是MSCs很难按预定方向分化，为此,需要从分子水平阐明MSCs分化过程的关键因子，并结合最新的组织工程技术从多方面研究MSCs的分化过程，实现其定向诱导分化成为视网膜各种细胞。在此过程中需要研究人员的不断探索。

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1.福建省重点科研课题(基金编号：2008Y0040)；2.国家卫生部科研基金课题(基金编号:WKJ2008-2-617)。

徐国兴，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。