高效异养硝化-好氧反硝化菌株的分离鉴定与脱氮性能

刘健楠，　汪　苹，　尹明锐，　王　磊

(北京工商大学 化学与环境工程学院， 北京　100048)

氮元素的严重超标将引起水体的富营养化及严重的生态环境污染等问题，因此，加强废水脱氮研究就显得尤为迫切[1-2]. 作为生物脱氮技术之一的好氧反硝化工艺与传统的缺氧反硝化工艺相比具有独特优势[3]: 1) 细菌能在有氧条件下进行反硝化，使硝化和反硝化能够同时在一个反应器中进行,可以大大减少占地面积和建设资金.2)硝化的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸、亚硝酸的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化反硝化进程. 且反硝化释放出的OH-可部分补偿硝化反应所消耗的碱，能使系统中pH值相对稳定. 3)在好氧脱氮过程中，进水中的高浓度有机物直接成为脱氮所需的外界碳源，脱氮同时解决了高COD的问题. 近年来，新的研究发现，有些好氧反硝化菌往往也能进行异养硝化，可以在有大量氧存在的条件下直接把氨氮转化为脱氮产物而去除，异养硝化-好氧反硝化已逐渐成为人们的研究热点和重点[4-6]. 目前，文献关于具有异养硝化-好氧反硝化能力菌株的N2O控逸研究报道不多. 本研究从实验室SBR反应器活性污泥中筛选兼具异养硝化-好氧反硝化性能的菌株，对其各种生长特性和脱氮性能、N2O逸出情况进行研究和鉴定，以期为该菌株的应用提供科学依据.

1　材料与方法

1.1　菌株来源

该菌株来源于以硝酸盐为底物的SBR反应器(TN去除率80.0%～85.0%，CODCr去除率85%～90%)中的活性污泥.

1.2　培养基

溴百里酚蓝(BTB)初筛培养基(g/L)[7]：琼脂20，KNO31，KH2PO41，FeC12·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸钠8.5，BTB(0.1 BTB溶于10 mL乙醇)1 mL，用1 mol/L的NaOH调节pH值至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 min，备用.

LB液体培养基(g/L)：KNO31,KH2PO41,FeCl2·6H2O 0.05,CaCl2·7H2O 0.02,MgSO4·7H2O 1,琥珀酸钠8.5，121 ℃灭菌20 min，备用.

DM反硝化培养基(g/L)[8]：KNO30.72，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸钠2.8，调节初始pH值7.0，121 ℃灭菌20 min，备用.

硝化富集培养基(g/L)：(NH4)2SO40.47，KH2PO41.0，FeCl2·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1.0，柠檬酸三钠4.08，121 ℃灭菌20 min，备用.

异养硝化培养基(g/L)：(NH4)2SO40.47，琥珀酸钠5.62，50 mL维氏盐溶液，121 ℃灭菌20 min，备用.

维氏盐溶液(g/L)：K2HPO45.0，FeSO4·7H2O 0.05，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 2.5，MnSO4·4H2O 0.05，溶解后加水定容至1 L.

1.3　菌株的筛选与脱氮性能测定

1.3.1菌株的筛选

采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL均匀涂布于BTB培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃培养2～3 d后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株. 将初筛菌株接种于琼脂斜面上，在4 ℃冰箱中保存.

1.3.2菌株的好氧反硝化性能测定

1.3.3菌株的异养硝化-好氧反硝化性能和脱氮产物N2O的测定[9-10]

1.4　菌株的鉴定

1.4.1形态观察

观察菌落形态并进行革兰氏染色，用扫描电镜观察[11]菌体形态.

1.4.2生理生化鉴定

依据《常见细菌系统鉴定手册》[12]进行生理生化测定.

1.4.3Biolog自动微生物鉴定

Biolog自动微生物鉴定系统[13]利用微生物对95种不同碳源的代谢情况来鉴定菌种，即各种菌形成各自特有的代谢指纹图谱，选用四唑类物质作为菌株能否利用供试碳源的指示剂. 将菌株接种于BUG+B平板培养基，37 ℃恒温培养16 h，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(GN/GP-IF+T)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至20%透光率. 用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog微孔鉴定板的各孔中，每孔150 μL. 将微孔鉴定板放在37 ℃培养箱中，在培养24 h后将其置于Biolog读数仪上与标准数据库进行对比并读取结果.

1.4.4菌株的分子生物学鉴定[14]

菌株的DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司). 16S rDNA基因扩增引物采用通用引物，正向引物为27f (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)，反向引物为1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由英俊生物科技有限公司合成. PCR反应体系(50 μL)：10×PCR Buffer(含15 mmol MgCl)5 μL，dNTPs 4 μL, 引物27f和1492r各2.5 μL，双重蒸馏水34 μL，混匀后加入DNA模板2.5 μL，Taq酶0.5 μL. PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性，30 s, 52 ℃退火，80 s, 72 ℃延伸，90 s，30个循环；72 ℃延伸8 min. PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析，交由天根生物科技有限公司测序. 将菌株的16S rDNA序列在GenBank核酸序列数据库中进行序列同源性比较，通过CLUSTALX[15]、MEGA[16]等软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-Joining[17]法构建系统发育树，分支聚类的稳定性用Bootstrap方法进行评价.

1.5　分析方法

1.5.1水体中各项指标的测定[18]

氨氮测定采用GB 7479—87纳氏试剂分光光度法，硝态氮测定采用GB 7480—87酚二磺酸紫外分光光度法，亚硝态氮测定采用GB 7493—87 N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法. 菌体量：光密度法，用721型分光光度计在600 nm处测定吸光度值. 水中CODCr采用CODCr快速测定仪(5B-1型，兰州连华仪器有限公司)测定.

1.5.2气体N2O的测定

该研究采用GC-TCD法测定N2O气体, 具体操作方法为: 每隔2 h在发酵罐排气口处用100 mL玻璃注射器缓慢匀速抽取气体, 立即注入用高纯氮清洗并抽成真空的500 mL或1 L气袋中. 测定时用10 mL气体样品锁式进样器(美国HAMILTON公司) 从气袋中准确抽取一定量气体进行GC-ECD分析. 气体N2O的测定选用的综合色谱条件为：检测器温度(TD)(350 ℃)、分离柱温度(TC)(50 ℃)、载气流速(fC)(20 mL/min). 实验中主要采用Varian 3800型气相色谱仪;10mci63Ni型电子捕获检测器(ECD); 3 m×3 mm不锈钢柱, 填充固体Porapak Q柱, 80/100目.

2　结果与讨论

2.1　菌株的形态学特征分析

菌株WYLW-X06在平板上培养24 h后，形成直径3～5 mm的圆形菌落，菌落表面粗糙、隆起，灰白色. 光学显微镜观察该菌为革兰氏阳性菌，杆菌，有芽孢. 电镜观察该菌呈直杆状，大小(10～13) μm×(3～4) μm，两端钝圆、无鞭毛. 菌株的电镜照片见图1.

图1　菌株WYLW-X06的电镜照片(20 000×)Fig.1　Electron microscope of WYLW-X06 strain(20 000×)

2.2　菌株的生理生化鉴定结果

细菌的新陈代谢类型不同，对各种生理生化试验的不同反应，显示出各类菌种间酶系统的不同，可作为细菌分类鉴定的重要依据. 菌株WYLW-X06生理生化鉴定结果见表1. 根据形态学和生理生化特征测定结果，初步鉴定菌株WYLW-X06是芽孢杆菌属(Bacillus.sp).

表1　菌株WYLW-X06的生理生化特征

2.3　Biolog鉴别分析

经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株WYLW-X06可利用95种碳源中的44种碳源，对其他51种碳源不能利用或利用能力较弱. 与标准数据库对比后，给出鉴定结果：该菌与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)标准菌株的相似性指数为0.644. Biolog鉴定结果如表2.

2.4　菌株WYLW-X06的分子生物学鉴定结果

2.4.1菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR扩增与测序

用菌株WYLW-X06的基因组DNA作模板，利用16S rDNA通用引物(27 f和1 492 r)进行PCR扩增，得到长约1.5 kb的目的片段，扩增结果见图2. 对扩增得到的16S rDNA片段测序，测得菌株WYLW-X06的16S rDNA总共1 440个碱基，在核酸数据GenBank (NCBI)申请的登录号为：GU116563.

表2　菌株WYLW-X06 Biolog特征

图2　菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR电泳图Fig.2　　　　Electrophoresis map of cloning procedure of 16S rDNA from WYLW-X06

2.4.2菌株WYLW-X06的系统进化分析

选取GenBank数据库中8株同源性相近的细菌与WYLW-X06构建系统进化树，结果见图3. 由图3看出，菌株WYLW-X06与蜡状芽孢杆菌属相似性最高，同源性达99%，所以菌株WYLW-X06是蜡状芽孢杆菌属的一种. 16S rDNA鉴定结果与Biolog鉴定结果相对照，可证实菌株WYLW-X06是蜡状芽孢杆菌.

图3　菌株WYLW-X06的系统进化发育树Fig.3　Consensus phylogenetic tree for strain WYLW-X06

2.5　菌株WYLW-X06的脱氮性能研究

2.5.1菌株WYLW-X06的好氧反硝化性能研究

以KNO3为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，初始氨氮浓度为78 mg/L，C/N为15，DO为120 r/min，pH值为7.0，温度30 ℃，连续培养4 d. 菌株WYLW-X06的培养液中氮素浓度的变化见图4.

图4　菌株WYLW-X06的好氧反硝化作用Fig.4　Aerobic denitrification of strain WYLW-X06

由图4看出，培养液中硝基氮质量浓度由初始的78 mg/L降低到2.09 mg/L，去除率达到97.32%，总氮去除率达到96.35%. 亚硝基氮浓度一直处于很低水平. 证明菌株WYLW-X06具有良好的反硝化能力，确实是一株高效的具有好氧反硝化能力的菌株.

2.5.2菌株WYLW-X06的异养硝化-好氧反硝化性能和脱氮产物N2O的研究

以(NH4)2SO4为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，初始氨氮浓度为85 mg/L，COD/N为20，DO为120 r/min，pH值为7.0，温度30 ℃，培养周期为58 h，取样时间间隔为2 h. 菌株WYLW-X06的培养液中氮素和碳源浓度的变化见图5.

图5　　　　好氧条件下菌株WYLW-X06对溶液中氨氮和碳源浓度变化的影响Fig.5　　　　Effect of strain WYLW-X06 on nitrogen and carbon source concentration in the denitrification culture medium under aerobic incubation

由图5看出，在发酵罐培养，实验结束时氨氮去除率达97.19%，总氮去除率96.63%，脱氮效果良好. 在培养过程中，从4h开始，OD600持续上升，56 h时达到最大值0.838. 同时仅能检测出少量硝基氮和亚硝基氮，说明菌株既进行了硝化作用，同时也进行了好氧反硝化作用. 值得关注的是，在菌株进行脱氮的同时，对培养液中碳源的消耗和利用也十分显著. CODCr从初始的1 565.20 mg/L降到培养结束时的165.6 mg/L，减少了1 399.6 mg/L，COD去除率达89.4%. CODCr的减少一方面是由于部分有机物被微生物分解而提供能量和被微生物利用合成了新的细胞物质所致，另一方面，大部分CODCr在反硝化阶段作为碳源被微生物直接利用了.

3　结　论

1)采用极限稀释和BTB培养基筛选的方法，并通过硝化-反硝化性能测定从味精废水末端处理系统的活性污泥中筛选出一株高效异养硝化-好氧反硝化细菌WYLW-X06. 通过形态特征观察、生理生化特征测定、Biolog鉴定，以及16S rDNA序列测定和系统发育分析，鉴定菌株WYLW-X06是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus).

2)在好氧条件下，异养硝化-好氧反硝化菌WYLW-X06能够高效脱氮，且生长适应性强. 在发酵罐中对菌株WYLW-X06进行扩大培养后，其氨氮去除率为97.19%，且反应过程中仅检测出少量的亚硝基氮积累. 该菌株的环境适应能力提高，硝化作用启动迅速，具有完整的脱氮酶系统，可进行从氨氮→硝基氮→亚硝基氮→脱氮气体产物这一完整的硝化-反硝化过程，同时该菌株产生的N2O是微量的，可实现N2O生物控逸的目的. 因此该菌株具有潜在工程应用价值.

3)作为细菌的鉴定手段，将Biolog系统与16S rDNA序列分析方法结合可以获得较可靠的鉴定结果. 两者相互验证，相互补充，提高了工作效率和结果的准确性，具有良好的可操作性.