康脑液 1号对大鼠脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及Bcl-2/Bax比值的影响

薛 茜,邹玉安,赵宝民,杨向方

脑缺血再灌注损伤导致的迟发性神经元损伤,主要与氧化应激反应、炎症反应及细胞凋亡等有关。康脑液 1号为临床治疗缺血性脑血管病的经验组方,临床疗效良好。药理研究证实康脑液 1号组方中单药如黄芪、三七、葛根等具有扩张血管、改善脑血流及微循环、降低血液黏度及血脂、抑制炎性反应等作用[1-4]。神经元凋亡是一种受基因调控的自主性、程序性细胞死亡过程,是脑缺血再灌注损伤的重要环节。Bcl-2/Bax比值与细胞凋亡调控有关。本研究通过观察康脑液 1号对局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带神经元凋亡和 Bcl-2/Bax比值的影响,探讨其可能的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠180只,体质量 (270±20)g,SPF/UAF级,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号:SCXK(京)2006-0008。称重后随机将大鼠分成 5组,每组 36只。 (1)假手术组;(2)模型组 (缺血再灌注组);(3)盐酸法舒地尔注射液组;(4)康脑液 1号 A组;(5)康脑液 1号 B组。

1.2 药物与试剂 康脑液 1号,由黄芪、三七等 8味中药组成,由河北北方学院第一附属医院中药房煎制。常规煎煮并浓缩至 4 g/ml。盐酸法舒地尔注射液 (川威):天津红日药业股份有限公司生产 (国药准字 H20040356;产品批号:060608;规格 2 ml:30 mg)。栓线购自北京沙东生物技术有限公司〔产品编号2432-100,线长40 mm,线身直径 0.24 mm,头端直径 (0.32±0.02)mm〕。凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司 (产品批号:10090522)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备 康脑液 1号采用灌胃法,盐酸法舒地尔注射液采用腹腔注射,均连续给药 7 d,每天早晨给药 1次,最后 1次给药 1 h后实施脑缺血再灌注手术,术后继续给药至再灌注各时间点 (12、24、72 h);给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算,康脑液 1号 A组剂量为 1.5 g·100 g-1·d-1,B组剂量为 3.0 g·100 g-1·d-1。假手术组和模型组大鼠自手术日前 7天开始给予等量去离子水灌胃。采用改良 Longa法[5]复制大鼠大脑中动脉栓塞模型 (MCAO),大鼠用 7%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰卧固定于大鼠解剖板上;剪去颈右前部手术区的毛,碘酒消毒,铺洞巾,于颈部行 15 mm旁正中纵行切口,并钝性分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉;用无损伤动脉夹夹闭颈总动脉近心端后,颈外动脉远端结扎,靠近颈内、外分叉处约 5 mm剪一小切口,迅速将栓线插入颈内动脉直至有轻微阻力感为止,模型组、盐酸法舒地尔组及康脑液1号 A、B组栓线插入深度为 (20.0±0.5)mm;假手术组麻醉同上,颈部切口暴露颈外动脉,不插线。实现大脑中动脉阻塞而致脑缺血;固定栓线去除动脉夹,栓线外留约 5 mm,逐层缝合;2 h后提拉栓线头端退回至颈外动脉内,实现大脑中动脉再灌注,造模完成。动物清醒后观察各组的活动度并采用 Longa评分标准进行神经功能评分 (0分:无神经功能缺损表现;1分:对侧前爪不能充分伸展;2分:行走时向外侧转圈;3分:行走时向对侧倾斜;4分:不能行走,意识丧失),1～3分者纳入实验,不符合模型判断标准的动物剔除。假手术组未脑缺血,评分均为 0分;模型组、盐酸法舒地尔组及康脑液 1号 A、B组手术均成功,均符合模型判断标准,纳入评分。

1.3.2 TTC染色及脑梗死体积测定 缺血 2 h再灌注24 h后,每组随机抽取 6只大鼠,快速断头取出鼠脑,置冰箱(-20℃)内 10 min后,切除嗅脑,取冠状面从前向后均匀切成 2 mm厚脑片 5～6片,将切片迅速置于 2%TTC溶液 (37℃水浴)中避光条件下染色 30 min。正常脑组织染成红色,缺血区呈灰白色,界线清晰。4%多聚甲醛固定 24 h。数码相机摄片,计算机图像分析,求得 TTC染色两侧正常区与梗死灶的面积。以缺血对侧脑片的面积减去缺血侧 TTC染色正常区的面积求得脑梗死面积。

1.3.3 HE染色观察病理形态 将实验大鼠缺血 2 h,至再灌注所需时间点时,用 7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常规灌注4%多聚甲醛 200 ml固定30 min。快速断头取脑,从前向后将脑组织分为 A、B、C、D、E 5等分,切成 2～3 mm厚的脑片,选取 C脑片,入 4%多聚甲醛固定液中继续固定 24 h。常规乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚度 5μm,4℃储存备用。

1.3.4 脑神经元凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)介导的地高辛 d UTP缺口末端标记法 (TUNEL)来识别凋亡细胞。

1.3.5 Bcl-2/Bax比值测定 采用 SP法进行检测,阴性对照用 0.01 mol/L PBS(p H 7.4)代替一抗。严格按说明书进行操作,DAB显色,常规脱水、透明、封片。抗体及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 (PV-6001,批号:K92708D)。抗体稀释液:ZL1-9029,批号:546892A。

1.4 统计学方法 所有数据以 (x±s)表示,采用 SPSS 16.0软件包进行统计学处理。多组间均值的比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为学评分及脑梗死体积 大鼠 MCAO术后多于1.5 h内清醒。假手术组大鼠活动度大。模型组大鼠术后精神较差,反应迟钝,蜷缩扎堆,24 h后仍然有蜷缩扎堆现象。康脑液 1号组和盐酸法舒地尔组的大鼠状态有一定好转,活动度较大,无蜷缩扎堆现象。术后 24 h康脑液 1号组和盐酸法舒地尔组 Longa评分低于模型组,差异有统计学意义 (P＜0.01,见表1)。缺血再灌注6 h即可看到明显梗死灶,累及右侧大脑半球基底核区、额顶叶皮质及海马区,随再灌流时间的延长梗死面积逐渐增大,至缺血再灌注 24 h时,模型组梗死面积为 (43.00±0.68)%,康脑液 1号 A、B组分别为(35.20±0.55)%、(35.00±0.37)%。康脑液 1号 A、B组与模型组相比梗死面积明显减小,差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表 1 各组大鼠神经功能行为学评分比较 (x±s,分)Table 1 Comparison of the neuralogical function score

2.2 组织病理学改变 高倍光镜下观察。(1)假手术组:大脑组织结构完整,无梗死灶及水肿。神经元、神经胶质细胞未见异常。细胞膜、核膜清晰,核仁明显。 (2)模型组:缺血第 1天,缺血对侧,细胞形态正常,核仁清楚。缺血侧皮质神经元数量明显减少,排列紊乱,组织间隙水肿严重。缺血半暗带明显,神经元稍小,形态基本正常;缺血灶中心区神经元体积明显缩小,部分细胞呈三角形,胶质细胞固缩。缺血第 7～14天神经元、胶质细胞、毛细血管、小血管与周围脑间质的间隙显著增大,间质疏松。病灶中心区随时间延长出现大量液化性坏死灶及囊性变,后期呈网状改变,残存细胞很少。(3)康脑液 1号 A组和 B组及盐酸法舒地尔组:在各个时间点与模型组相比,神经元形态改变较轻,细胞体完整,突起较清楚,基本保持完整。可见尚存的大脑皮质的正常神经元排列结构,且组织间隙水肿较模型组明显减轻,神经元、胶质细胞和血管大量变性坏死等缺血性改变和炎性反应明显轻于模型组。

2.3 康脑液 1号对大鼠脑缺血半暗带神经元凋亡及 Bax/Bcl-2比值的影响 光镜下 (×400)细胞核内存在棕黄色颗粒者为凋亡细胞。在梗死周边区随机选取 10个互不重叠视野,计数阳性细胞数。各时间点模型组细胞凋亡数及 Bcl-2/Bax比值明显高于假手术组 (P＜0.05);与模型组比较,康脑液 1号 A组和 B组、盐酸法舒地尔组细胞凋亡数目减少 (P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高 (P＜0.05,见表 2、3)。

表 2 各组大鼠缺血半暗带神经元凋亡数目比较 (x±s)Table 2 Comparison of the numbers of the neuronal apoptosis cells around the necrotic area in rats

表 3 康脑液 1号对缺血再灌注大鼠缺血半暗带 Bcl-2/Bax比值的影响(x±s)Table 3 The effectsof kangnao ye 1 on the Bcl-2/Bax ratio after the focal cerebral ischemia-reperfusion around the necrotic area in rats

3 讨论

近年来,关于中药复方治疗脑卒中的研究进展迅速。康脑液 1号中黄芪为君药,三七、葛根、天麻、川芎共为臣药,佐以钩藤、地龙,同时川芎、地龙又具引药之性,二药轻清引上,直达病所。黄芪益气升阳,三七活血止血[6],钩藤熄风镇惊,地龙清热利湿,天麻、川芎定风[7]。对脑缺血损伤的神经保护作用的机制可能为多水平、多通道、多靶点的综合效应。

研究表明,缺血半暗带的细胞凋亡与疾病转归相关。细胞凋亡是细胞为维持其内稳态的自主程序性死亡 (programmed cell death,PCD)。抑制缺血后神经元凋亡对保护神经元具有重要意义。细胞凋亡的机制与凋亡基因表达有关,即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因。

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡调控蛋白,主要分布于线粒体、内质网和细胞核的外膜[8]。Bcl-2蛋白家族根据其作用分为 2类:一类为抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一类为促凋亡蛋白,如 Bax蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间相互拮抗。Bcl-2蛋白能够抑制 Bax蛋白启动凋亡机制。而 Bax蛋白作为 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员,可以不依赖于激活或抑制其他相关基因而诱导细胞凋亡。细胞是否进入凋亡程序决定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相对值,Bcl-2/Bax的比值改变与神经元凋亡密切相关[9]。

以往研究显示脑缺血后促凋亡蛋白 Bax表达明显增加,且Bax阳性反应位于 TUNEL阳性的细胞内,其时程与空间的分布与 TUNEL阳性神经元一致[10]。Bcl-2/Bax比值的改变可能调控了神经元的凋亡。研究表明,细胞受刺激后 Bcl-2/Bax比值越高,细胞存活率越高,细胞凋亡率越低。

本研究结果发现缺血再灌注后大鼠神经元凋亡数目、Bcl-2/bax比值均明显高于假手术组;Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔注射液对脑缺血再灌注具有很好的改善作用[11-12],可降低凋亡率,升高 Bcl-2/Bax比值。本研究显示,康脑液 1号A组和 B组可上调脑缺血再灌注诱导的 Bcl-2蛋白表达,同时下调 Bax蛋白表达,使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2异源二聚体形成,抑制细胞凋亡。康脑液 1号 A组和 B组不同剂量给药对大鼠神经元凋亡数目、Bcl-2/bax比值的影响无显著性差异,符合临床中医中药辨证论治理论。中药组方中各单味中药之间的比例是关键,而中药组方的总剂量对治疗无决定性作用。经康脑液 1号治疗后,梗死灶明显减小,脑神经元凋亡减少,Bcl-2/Bax比值明显高于缺血再灌注组,说明康脑液 1号可能通过抑制脑神经元凋亡,达到保护缺血半暗带目的,从而起到保护大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用。

综上所述,康脑液 1号可明显减少 MCAO大鼠缺血半暗带神经元凋亡,其机制可能与提高 Bcl-2/Bax比值有关,这可能是其促进神经元修复及重塑的机制之一。为临床应用康脑液 1号治疗缺血性脑血管疾病提供了一定的实验依据。

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