离子液体微波辅助萃取金银花中绿原酸的研究

李庆龙，曲有乐，欧阳小琨

(1.浙江海洋学院食品与药学学院、医学院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007)

离子液体是在室温及相邻温度下完全由离子组成的有机液体熔融盐[1，2]，具有蒸汽压低、挥发性小、溶解能力强、萃取能力好、液态范围宽等独特的物理化学性质，对微波具有强的吸收和热转换能力。离子液体作为一种可设计的绿色溶剂广泛应用在液/液萃取、液相微萃取、固相微萃取、双水相萃取。离子液体与传统的有机溶剂相比，具有热稳定性好、不爆炸、不易燃烧、不挥发、便于重复利用的特点[3-5]。以离子液体作为溶剂，可以减少在萃取过程中的环境污染。

微波萃取技术(MAE)具有萃取速度快、产率高、安全无污染等优点，将微波萃取技术和离子液体结合起来，形成了一种新型的萃取方法应用于萃取分离领域，使其具有二者各自的优点，可达到理想的萃取分离目的。杜甫佑等[6-8]以离子液体溶液为溶剂，研究了离子液体微波辅助萃取石蒜中石蒜碱、力克拉敏和加兰他敏生物碱，并与传统有机溶剂和传统萃取技术进行了对比研究，结果显示本方法快速高效、环境友好。本文在有机溶剂MAE萃取绿原酸的研究工作基础上，以离子液体溶液为溶剂，微波辅助萃取金银花的绿原酸，并与传统萃取方法进行对比研究。

1 材料与方法

1.1 材料

绿原酸标准品（中国药品生物制品鉴定所）；金银花（购于舟山市芝林大药房）。

1.2 试剂与仪器

溴代正丁烷（化学纯），乙腈（色谱纯），其余所用试剂均为分析纯。

DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Feb85-2恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；RE-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA1004N电子天平（上海民桥精密科技仪器有限公司）；SHB-IIIA循环水式多用真空泵（河南省太康科教器材厂）；XH-100A电脑微波催化合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；800B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；伊利特1201高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂的预处理

1-甲基咪唑：加入KOH干燥24 h，130℃下减压蒸馏出1-甲基咪唑；正溴丁烷：加入CaCl2干燥24 h，70℃下减压蒸馏出正溴丁烷；硝酸银（AR）溶液：在避光条件下称重1.019 2 g的AgNO3，用去离子水溶解，然后稀释至100 mL于棕色瓶中保存，备用。

1.3.2 中间体 1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）的制备

反应式如图1所示。取重蒸的1-甲基咪唑和溴丁烷各0.5 mol至于500 mL圆底烧瓶中，油浴加热并进行搅拌，调节加热功率使加热油的温度在10 min中内从室温升到140℃，烧瓶内生成白色乳状物，当白色乳状物消失后溶液变为金黄色，撤去油浴锅继续搅拌，温度降至室温再置于140℃油浴下反应15 min[9]，得到金黄色液体[Bmim]Br，生成物用二氯甲烷溶解，活性炭脱色纯化2～3次，再旋转蒸发除去二氯甲烷，在398 K（125℃）下真空干燥12 h后取出，底层析出白色针状晶体，用活性炭脱色后得率为86.8%。

图1 [Bmim]Br的反应历程Fig.1 Scheme of[Bmim]Br

1.3.3 [Bmim]BF4的制备

反应式如图2所示。取中间体0.1 mol[Bmim]Br和 0.11 mol NaBF4，加入到250 mL锥形瓶中，以丙酮作溶剂，在磁力搅拌下室温反应24 h，真空抽滤反应液，除去生成的NaBr，然后减压蒸馏出滤液中的丙酮后，加入二氯甲烷，进一步析出白色固体NaBr，真空抽滤，滤液经减压蒸馏出二氯甲烷，重复操作2～3次，直到没有白色固体(NaBr)析出为止，将产物置于真空干燥箱，70℃干燥至无失重，得无色粘稠液体[Bmim]PF4，得率为90.1%。

图2 [Bmim]BF4的反应历程Fig.2 Scheme of[Bmim]BF4

2 结果与讨论

2.1 [Bmim]BF4的表征

2.1.1 红外图谱解析

对[Bmim]BF4离子液体进行红外光谱检测，测定波数范围4 000～400 cm-1。3 161～3 170 cm-1是咪唑环上的C-H伸缩振动峰；2 967～2 968 cm-1是咪唑侧链上CH3-和-CH2-的伸缩振动峰；1 465～1 574 cm-1是咪唑环的骨架振动；1 169～1 167 cm-1是咪唑环C-H面内弯曲振动峰；1 047 cm-1是B-F的伸缩振动峰。图谱显示的特征与文献[10]一致。

2.1.2 核磁图谱解析

以CDCl3为溶剂对[Bmim]BF4进行核磁共振氢谱分析。核磁共振主要数据见表1。

表1 核磁共振氢谱数据Tab.1 Data of NMR-H1

在δppm=0.95处积分面积为3.02的三重峰，表明有3个质子，是正丁基末端的甲基；在δppm=1.38处积分面积为2.05的六重峰，表明有2个质子，为正丁基上甲基旁边的亚甲基；在δppm=1.86处积分面积为2.1的五重峰，表明有2个质子，为与氮相连正丁基上的亚甲基2个氢，受到旁边4个氢的作用分裂成五重峰。在δppm=3.9处有个积分面积为3.05的单峰，表明有3个质子，证明为与氮相连的甲基，化学位移比正丁基上的甲基高；δppm=4.20处有个面积为2.0的三重峰，表明有2个质子，证明为与氮相连的亚甲基上的2 个氢；在 δppm=7.34 和 δppm=7.26 两处有 2 个峰，积分面积分别为 0.98 和 0.99，推定为咪唑环上的另外2个氢，由于它们处在相似的化学环境下，所以具有相近的化学位移值；在δppm=9.0处有一个单峰，积分面积为1.00，表明此处为单个质子，咪唑环上2个氮原子之间碳上相连的氢符合此条件。综合以上分析，可以确定此谱图为1-甲基-3-丁基咪唑阳离子，阴离子为BF4-离子，对氢谱没有影响。

2.2 [Bmim]BF4水溶液微波辅助萃取金银花中绿原酸

2.2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm)，流动相：乙腈-0.4%磷酸(1∶9)，检测波长：327 nm，柱温：室温，流速：1 mL/min，进样量：5 μL。在选定的色谱条件下，金银花提取液中的绿原酸峰对称性好，并可以与其它组分达到基线分离。

2.2.2 绿原酸标准曲线的制作

准确称取绿原酸标准品10 mg，加4 mL甲醇（AR），制成2.5 mg/mL的母液，吸取母液分别配制成浓度为：0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL 的绿原酸标准溶液，摇匀，按照 2.2.1 的色谱条件进行HPLC分析，以绿原酸的浓度（x，mg/mL）与峰面积(y)绘制标准曲线，得到标准曲线方程为：y=12 634 x-185.57(R2=0.995)。

2.2.3 萃取条件优化

2.2.3.1 萃取溶剂筛选

分别准确量取15 mL的水、V水：V[Bmim]BF4=11:4的离子液体、50%甲醇和50%乙醇各1份，将准确称取的1 g金银花粉末加到各自溶剂中，在900 W、70℃微波辅助条件下分别萃取5 min，离心10 min，分别取上清液进行HPLC检测。不同萃取溶剂萃取绿原酸的得率如图3所示。

图3 不同溶剂对绿原酸得率的影响Fig.3 Effect of different solvents on yield of chlorogenic acid

从图3中各种溶剂提取绿原酸可知，对比纯水做溶剂，离子液体溶液的加入影响金银花中绿原酸的萃取得率，高于水（2.78%），高于 50%乙醇溶液（6.25%），高于 50%甲醇（3.5%），并且由高效液相色谱图可知，利用离子液体溶液萃取所得杂质最少，其他溶剂萃取绿原酸的峰面积小于或接近离子液体萃取的峰面积，但经萃取获得的杂质明显较多。甲醇有毒易挥发污染环境，对人的健康造成危害。离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的有机盐，对微波具有强吸收和转化能力，能有效提高离子液体溶液对微波的吸收和转化，使溶剂和样品迅速升温，快速萃取样品中的绿原酸。因此本文选择[Bmim]BF4的水溶液为萃取剂萃取金银花中的绿原酸。

2.2.3.2 V[Bmim]BF4水溶液体积比的优化

分别配置15 mL的水和[Bmim]BF4的混合萃取溶剂5份，水和[Bmim]BF4的体积比分别为：14:1、13:2、12:3、11:4、10:5，分别准确称取1 g金银花粉末加到5份混合萃取溶剂中，在900 W、70℃微波辅助条件下萃取5 min，萃取液离心10 min，分别取上清液进行HPLC检测。不同体积比的离子液体/水萃取绿原酸的得率如图4所示。

由图4可以得出，当V[Bmim]BF4/V水从1/14增加到4/11时，绿原酸的得率增加了10%。再将V[Bmim]BF4/V水从4/11增加到5/10时，绿原酸的得率下降了4.2%，其主要原因是：当V[Bmim]BF4/V水为4/11时，离子液体溶液将绿原酸从样品中基本萃取完全，得率达到最大值(1.43%)，当加大V[Bmim]BF4/V水时，样品中残留的绿原酸很难被萃取出来，并且由于离子液体的增加，使溶液的粘度增大、扩散能力变差，溶液更难渗入到样品基质的内部，导致提取率下降。因此，选择V[Bmim]BF4/V水比4/11为提取金银花中绿原酸的萃取溶剂。

图4 水和[Bmim]BF4体积比对绿原酸得率的影响Fig.4 Effect of different of V[Bmim]BF4/Vwateron yield of chlorogenic acid

2.2.3.3 微波萃取功率的优化

配置15 mL体积比为11：4的水和[Bmim]BF4混合萃取溶剂5份，分别准确称取1 g金银花粉末加到5份混合萃取溶剂中，在70℃萃取功率分别为900 W、800 W、700 W、600 W、500 W微波辅助萃取5 min，萃取液离心10 min，分别取上清液进行HPLC检测。不同功率萃取绿原酸的得率如图5所示。

从图5可以看出，当功率从500 W增加到600 W时，绿原酸提取率增加，在功率600 W时，达到最大值（1.43%），绿原酸的提取率随微波功率的增大而增加；当功率超过600 W后，提取率开始下降，由于离子液体溶液吸收微波的能力较强，因此用小功率即可将样品中的绿原酸萃取完全，功率过大使绿原酸降解，并且浪费能源，增加了成本。因此本实验最优的提取功率为600 W。

图5 微波功率对绿原酸得率的影响Fig.5 Effect of microwave power on yield of chlorogenic acid

2.2.3.4 萃取时间的优化

配置15 mL体积比为11:4的水和 [Bmim]BF4混合萃取溶剂5份，分别准确称取1 g金银花粉末加到5份混合萃取溶剂中，在600 W、70℃微波辅助条件下分别萃取 3 min、5 min、7 min、9 min、11 min，离心 10 min，分别取上清液用HPLC检测绿原酸的收率。不同萃取时间所得绿原酸的得率如图6所示。

由于微波辅助萃取技术具有加热快速高效的特点，一般在10 min内萃取完样品中的目标物。从图6可知，萃取时间从3～9 min，绿原酸得率一直增加，在9 min得率达到最大值(1.475%)，提取超过9 min后，提取率下降，因为萃取时间过长，绿原酸可能被降解。因此，本实验的最优萃取时间为9 min。

图6 萃取时间对绿原酸得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on yield of chlorogenic acid

4 结论

(1)本文合成了[Bmim]BF4离子液体，采用微波辅助萃取技术从金银花中提取绿原酸。利用微波萃取快速、离子液体绿色环保的优点，将两者结合起来，提出具有实际应用价值的萃取方法，该法可以用于金银花中绿原酸的快速高效萃取。

(2)对离子液体微波辅助萃取金银花中绿原酸的工艺条件进行了优化，并与传统溶剂提取进行了比较，离子液体溶液作为萃取剂比常规溶剂萃取效率高。实验结果对于天然活性成分的提取有较好的参考价值。

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