植物叶形态解剖结构的简易快捷观测方法筛选

2010-07-09刘锦妍李富恒谭大海岳明翠黄福山

东北农业大学学报 2010年5期

刘锦妍，李富恒，谭大海，岳明翠，黄福山

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

植物的形态解剖结构观测有很多方法，观测叶片表皮细胞及气孔的方法有离析法[1-3]、印迹法[4-5]、刀刮法、撕剥法等；观测叶片及叶柄横切面的方法除石蜡切片法外，其他方法尚未见报道；叶片脉序的观测有标本经脉络法等[6-7]。以上大多数方法都存在着成本高、耗时多、操作不便以致在教学中难以广泛应用、所用化学试剂对人体有害等缺点。笔者在研究中发现，利用各种食用胶（明胶、琼脂和卡拉胶等）的可塑性、透明性和胶粘性等特点来获得植物材料的细胞痕迹，不仅可进行叶片表皮细胞的观测，也可以进行叶片及叶柄横切面细胞的性状观测。文章对利用各种食用胶获得植物材料细胞痕迹的效果和操作方法进行了较为详尽的研究，为今后深入的研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为番茄（Lycopersicun esculentum Mill.）、茄子（Solanum melongena L.）、抱子甘蓝（Brassica oleracea L.var.gemmifera Zenker）、花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis L.）等蔬菜作物的叶片和叶柄；食用类以及分析纯类的各种食用胶（明胶、琼脂和卡拉胶），其中食用明胶可根据粘度系数分成不同等级（12、16、20、30、40°等）。

1.2 方法

1.2.1 各种胶溶液的配制

称取一定量的固体胶置于小烧杯中，加入蒸馏水配成一定浓度的溶液。水浴加热，同时用玻璃棒慢慢搅拌，使其完全溶解形成胶液，加入少许染料使其颜色加深，将小烧杯静置于40～60℃温水的大烧杯中待用。

1.2.2 叶片表皮和横切面细胞痕迹的制取

将制成的各种胶溶液平铺在载玻片上，将叶片平铺或立在凝固的胶溶液上面，室温下放置一段时间后，当胶溶液完全凝固时用镊子将叶片揭下来，就会留下清晰的叶片表皮和横切面细胞痕迹。

1.2.3 叶柄横切面细胞痕迹的制取

将制成的各种胶溶液平铺在载玻片上，将一段叶柄立在凝固的胶溶液上面，室温下放置一段时间后，当胶溶液完全凝固时用镊子将叶柄揭下来，就会留下清晰的叶柄横切面细胞痕迹。同时做徒手切片，比较两种方法的效果。

1.2.4 叶片脱色方法

为了研究叶片输导组织（维管束）的数量性状，需要用有机溶液将叶片的绿色脱去且要保持叶片逐渐脱水而不变形。经过多次试验，我们摸索出了一套能达到上述要求的试验方法。具体如下：选取所需叶片在沸水中煮5 min，使叶片软化并排除叶片内的空气，每个叶片分别在梯度浓度为20%、50%、70%的乙醇溶液中各浸泡2 h，使叶片逐渐脱水而不变形。然后将脱水过的叶片放在由95%乙醇和100%丙酮组成的不同比例混合溶液中浸泡，共设计了五个脱色溶液配方：95%乙醇、75%乙醇+25%丙酮、50%乙醇+50%丙酮、25%乙醇+75%丙酮、100%丙酮。比较各种脱色溶液的脱色效果，直至完全脱色为止。

2 结果与分析

2.1 用琼脂和卡拉胶制取细胞痕迹的效果

用食用类以及分析纯的琼脂和卡拉胶，每种类型的胶均进行不同浓度、不同染色剂处理，制取植物细胞痕迹的效果见表1、2。

表1 用不同处理的琼脂凝胶制取细胞痕迹的效果Table 1 Effect of cell mark get from different agar gel treatment

表2 用不同处理的卡拉胶凝胶制取细胞痕迹的效果Table 2 Effect of cell mark get from different carrageenan gel treatment

由表1、2可知，琼脂和卡拉胶不适合用来制备植物细胞痕迹，所制取的细胞痕迹不清晰。其原因是这两种胶所制胶液透明度和柔韧度较差，难以满足印迹法的要求。

2.2 用明胶制取细胞痕迹的效果

用不同等级（粘度系数分别为 12°、16°、20°、30°、40°）的食用类及分析纯明胶，每种类型的明胶均进行不同浓度、不同染色剂处理，所制取的植物细胞痕迹效果见表3。由表3可知，粘度系数为16°和40°的食用类明胶及分析纯明胶效果最好。

2.3 明胶溶液在载玻片上的适宜凝固时间

对不同浓度、各类型的明胶溶液在载玻片上放置不同的时间，然后放置植物材料制取细胞痕迹，在显微镜下观察，找出能制取清晰细胞痕迹的各类型不同浓度明胶溶液的适宜凝固时间，结果见表4。

表3 用不同处理的明胶凝胶制取细胞痕迹的效果Table 3 Effect of cell mark get from different gelatin gel treatment

表4 不同浓度明胶的适宜凝固时间Table 4 Suitable solidifying time of different concentration of gelatin

表4中的适宜凝固时间即明胶溶液将要凝固的时间，也就是在胶液面上恰好能够支撑植物材料的最短时间。从表4中可以看出，胶液浓度越大，最佳凝固时间越短；反之越长。在操作过程中分析纯类明胶以15%左右的浓度为宜；食用类明胶以20%左右的浓度为宜，既有利于操作，又能取得较好的观测效果（见图版I）。

2.4 不同熔化温度对分析纯类明胶制取细胞痕迹效果的影响

由于分析纯明胶类含杂质少，制取细胞痕迹的效果最好，今后的应用前景最广。因此我们研究了不同熔化温度对分析纯类明胶制取细胞痕迹的效果影响，结果见表5。

从表5的试验结果可以看出，除在100℃煮沸的条件下，其余温度处理（40～90℃）对分析纯类明胶制取细胞痕迹效果的影响差别很小，均可用于具体试验操作过程中。但在试验操作过程中，在允许的范围内应使水浴的温度尽可能高一些，可加速明胶的熔化速度，提高工作效率。

2.5 乙醇和丙酮及其混合溶液配制比例对叶片脱色效果的影响

叶绿素不溶于水，而溶解于乙醇和丙酮等有机溶液中。为了便于观测、提高脱色效果我们设计了五个脱色溶液配方，脱色15 d，比较各种脱色溶液的脱色效果。结果表明，在所设计的五个叶片脱色溶液配方中，95%乙醇脱色效果最好；75%乙醇+25%丙酮和50%乙醇+50%丙酮两个配方其次；25%乙醇+75%丙酮和100%丙酮两个配方脱色效果最差。

图版I 用明胶制取植物细胞痕迹的效果Plate I Effect of cell mark get from gelatin gel

表5 不同熔化温度对分析纯类明胶制取细胞痕迹效果的影响Table 5 Effect of different melting temperature on the cell mark get from analytically pure gelatin

2.6 叶柄横切面解剖结构的制取方法比较

用两种方法制取叶柄横切面的解剖结构：①印迹法：与叶片表皮和横切面细胞痕迹的制取方法相同，用分析纯明胶处理；②徒手切片法：将欲观察的叶柄部位用新的刀片迅速切割，放在番红溶液中染色1～2 min后，取出制成临时切片即可在显微镜下观测叶柄维管束的数量性状，并可进行显微摄影。

结果表明，这两种方法都适用于叶柄横切面解剖结构的制取，都能取得较好的制片效果。但相比之下徒手切片法操作更为简便、观测效果更好（见图 1）。

图1 徒手切片法效果(茄子叶柄,×40)Fig.1 Effect of bare-handed sectioning(Eggplant petiole,×40)

3 讨论

3.1 用明胶溶液制取细胞痕迹的优点

用明胶溶液制取细胞痕迹（印迹法）观测植物叶的形态解剖学数量特性的方法具有操作简便、节省时间、成本低廉、占用时间少、对人体无毒、需仪器设备少等特点，极大地简化了植物解剖学方面的研究工作。本研究的相关内容可用于中学生物课及大专院校生物类和农学、园艺类专业的教学工作，为植物发育生理和植物解剖学的教学和科研工作提供了一个简便、快速的新方法，丰富了植物学制片技术。如在全国范围内推广，每年可节省大量教学经费。

3.2 印迹法的应用前景

印迹法是一种把细胞痕迹粘取在某种介质上来观测植物叶形态解剖学数量特性的方法，包括指甲油法、透明胶带法、火棉胶法等。但过去这些方法只用于观测叶片表皮结构，应用范围有限。通过我们的试验观察，印迹法不仅适用于观测叶片表皮结构，也适用于叶片叶柄横切面结构的观测，但要注意探索适用于不同作物叶片的具体操作方法。

3.3 叶片脉序的观测

用于叶片输导组织（维管束）的观测，需将材料透明和漂白，使叶片呈白色并变为透明直接显示内部的结构。常用的是标本经脉络法，即先将叶片放入水中煮沸10～20 min，使叶片软化并排除叶片内空气，再放入10%的NaOH溶液中透明，5%～10%的NaClO溶液漂白。不同作物叶片所需水煮时间、NaOH溶液透明和NaClO溶液漂白的浓度和处理时间均不相同，需探索适于不同作物叶片的具体操作方法。

此外，通过试验观察，95%乙醇处理也能达到同样的目的。此外，叶片表皮观测方法中的离析法不仅适用于分离上下表皮，而且也可用于研究叶片输导组织（维管束）的观测，制片效果非常理想。