红细胞胆固醇荧光测定高脂血症及冠心病 58例分析

陕西省中医医院检验科(西安 710003)张砚敏 胡 凯 张 蕾

胆固醇是确诊高脂血症的重要指标之一。经对国内外大量文献书籍查阅,红细胞胆固醇(Erythrocytc cholesterol,E-ch)含量较之血清胆固醇含量更能客观、灵敏的反应一些疾病的存在,如冠心病[1]、动脉粥样硬化[2],原发性高血压[3],糖尿病[4],甲状腺功能亢进[5]等。而目前用样量少,精密度,准确度好的红细胞胆固醇含量检测方法仅适于科研。建立具有较高精密度、准确度和较大检测能力,微量快速,简便易行,临床适用的红细胞胆固醇测定法,日益受到国内外的重视,且势在必行。我院经查阅国内外有关资料,初步建立了红细胞胆固醇荧光测定法,现分析报告如下。

对象与方法

1 研究对象 高脂血症组:40例,其中男 20例 ,女 20例,平均年龄 50± 2岁;血浆 TC均≥ 6.47 mmol/L;冠心病组:18例,其中男 15例,女 5例,平均年龄 65±6岁,临床均明确诊断为冠心病患者;健康对照组:40例 ,其中男 20例 ,女 20例 ,平均年龄 50±2岁,均系本院体检正常职工。

2 试剂与仪器 胆固醇酶试剂盒(东瓯),1mmol/LL-酪氨酸 (AR),pH10.5、0.1mol/L N H3-N H4Cl缓冲液,SFM-25荧光仪(Kontron,Gemany),7060型生化分析仪(HITACHI),SF3000血球分析仪(SYSTEM)。

3 测定原理 利用双蒸水破坏红细胞膜,溶血,充分暴露红细胞膜内外层的胆固醇酯、游离固醇,二者在胆固醇酯酶(CEH)、胆固醇氧化酶(CHOD)的作用下,生成 4-胆甾烯酮和H2O2,H2O2在过氧化物酶的催化下氧化底物酪氨酸,产生具有荧光的酪氨酸二聚体,此荧光的激发波长 317nm、发射波长411nm[5],用荧光仪检测荧光强度,荧光强度与胆固醇的浓度呈正比,与标准曲线比较求出全血胆固醇浓度。经过(全血 Tc-血浆 Tc)/红细胞压积+血浆 Tc,计算出红细胞胆固醇浓度。

4 检测方法[6]

4.1 血浆胆固醇测定:取静脉血 3ml肝素抗凝,用于在生化分析仪上检测血浆胆固醇含量、在血球分析仪上检测血球压积。

4.2 红细胞胆固醇测定 :取抗凝血 0.05ml,加 1ml双蒸水制备溶血液[6]。取溶血液 10μl,加入 1ml酶试剂,再加 1ml酪氨酸试剂,置 37℃15min,加 4mlNH3-NH4+缓冲液为测定管,空白管将酶试剂改为双蒸馏水,其余操作与测定管相同,系列胆固醇浓度标准管 (2.1、 4.5、6.6、8.9、 11.2)mmol/L,操作与测定管相同,用荧光仪检测荧光强度,与标准曲线比较求出全血胆固醇浓度。

4.3 计算方法:红细胞 Tc(mmol/L)=(全血 Tc-血浆Tc)/红细胞压积+血浆 Tc。

结 果

1 红细胞胆固醇与血浆胆固醇测定结果对比 见附表。红细胞胆固醇男性高于女性,且在冠心病组中明显升高;而血浆胆固醇在高脂血症组中升高。

附表 红细胞 Tc血浆 Tc测定结果对比(mmol/L,±s)

附表 红细胞 Tc血浆 Tc测定结果对比(mmol/L,±s)

组 别 n 红细胞 血 浆正常男性 20 4.63± 0.56 4.84± 0.79正常女性 20 3.82± 0.55 4.82± 0.89冠 心 病 18 5.55±0.57 4.64±0.71高脂血症 40 4.55± 0.47 7.64± 0.91

2 精密度 批内:4.11±0.115mmol/L,CV=2.7%(n=20);批间:4.21± 0.135 mmol/L,CV=3.2%(n=20)。

3 线 形范围 定值血清稀 释为 (2.1、3.2、 4.5、 5.5、 6.6、7.8、 8.8、 9.8、 10.8、 11.8、12.8、 13.8、 14.8)mmol/L,测定上界为13mmol/L。

4 回收率 本组回收率为 96.1%～99.3%,平均 97.5%。

讨 论

红细胞胆固醇水平的测定,已被临床逐步采用,但由于用样量少,精密度,准确度高的红细胞胆固醇含量检测方法繁琐,操作时间过长,所需仪器设备价昂,仅适于科研,难以在一般实验室中开展和在临床广泛应用。因而许多学者致力于研究建立一种微量快速、简便易行、准确、精密的检测方法。

本组应用红细胞胆固醇荧光测定法对 40例高脂血症、18例冠心病患者及 40例健康对照者进行测定,其结果显示:冠心病组与正常对照组比较,血浆胆固醇并无多大差异,但红细胞胆固醇含量明显高于对照组,表明红细胞胆固醇是比血浆胆固醇更灵敏的冠心病的检测指标。在高脂血症患者中,虽然血浆胆固醇明显高于正常对照组,但红细胞胆固醇却无异常,这与国内有关报道一致,国内有关报道认为血浆胆固醇与红细胞胆固醇含量变化是一致的,其原因有待于进一步研究,红细胞内胆固醇男性高于女性,可能与性激素分泌有关,确切机制仍有待于进一步研究证实。

红细胞胆固醇测定一是利用胆固醇与酶试剂作用产生的H2O2氧化底物酪氨酸,产生具有荧光的酪氨酸二聚体,通过检测酪氨酸二聚体的荧光强度可对全血胆固醇定量测定。荧光法较之以往的吸光度法有更高的灵敏度、精密度、准确度。二是无需用有机溶剂抽提胆固醇,避免有机溶剂沉淀蛋白质造成的胆固醇丢失,避免有机溶剂对酶活性的干扰,避免试验中水相有机相两相互相转换造成的误差、计算复杂等。三是不洗涤红细胞,避免了繁琐操作,减少了干扰因素。四是此方法简便易行,微量快速,试剂无毒,无腐蚀,无需特殊防护措施。

[1]许延康,吴秋玲,龙江斌,等.红细胞胆固醇含量在冠心病诊断上的意义[J].中华心血管病杂志,1983,11(2):92-95.

[2]周君富,黄鉴政.人红细胞胆固醇含量的增龄变化 [J].中国老年医学杂志,1995,15(1):27-30.

[3]符云峰,董玉枝,李 红,等.原发性高血压患者红细胞膜脂质组成及流动性变化的研究[J].天津医药,1991,8:486-487.

[4]栗夏莲,欧阳安,周慕英,等.甲亢病人血清及红细胞膜胆固醇含量的变化 [J].中华内分泌代谢杂志,1990,6(3):175-176.

[5]王全林,刘志洪,蔡汝秀,等.血红蛋白催化荧光法测定其氢供体底物酪氨酸[J].分析实验室,2004,24(2):46-49.

[6]郑才岳.红细胞内胆固醇简易测定法及其临床意义 [J].陕西医学检验,1994,9(2):74-75.