左卡尼汀对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠ATP酶活性的影响

韩征宇,李光来

左卡尼汀(Levocarnitine),也称左旋肉碱,是一种广泛存在于机体组织内的特殊氨基酸,其基本生理功能是转运脂肪酸进入细胞线粒体,通过β-氧化进入三羧酸循环,为细胞提供能量,且通过新型有机阳离子转运蛋白2(OCTN2)很容易通过血脑屏障[1]。本研究采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,观察左卡尼汀对缺血再灌注模型大鼠脑组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、总ATPase活性的影响,探讨其脑保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 选用健康雄性W istar大鼠(山西医科大学实验动物中心提供)40只,鼠龄3个月～4个月,体重250 g±15 g。左卡尼汀(珠海亿邦制药有限公司,批号20090102);ATP酶试剂(南京建成生物工程研究所提供);普通试剂由山西医科大学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药方法 健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为假手术组(A组)、生理盐水对照组(B组)、左卡尼汀100 mg/kg治疗组(C组)、左卡尼汀200 mg/kg治疗组(D组),每组10只。B组、C组、D组制作模型前30 m in分别以生理盐水1 m L,左卡尼汀100mg/kg、200mg/kg腹腔注射。

1.2.2 右侧大脑中动脉缺血再灌注模型的建立 采用改良Longa法[2]建立大鼠脑缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3 m l/kg腹腔麻醉,颈正中右旁开0.5 cm～1.0 cm切口,钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,结扎颈外动脉、颈总动脉近心端,在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口,将直径0.236mm的进口尼龙鱼线插入,以分岔口处开始测量距离,插入1.8 cm～2.0 cm后固定鱼线,缝合。缺血2 h后将线栓拉出1 cm左右即可,形成再灌注。其中假手术组插入1.0 cm鱼线,其余步骤同实验组。神经功能缺损评分:按照Longa等[2]的5级4分法标准,神经功能缺损评分在1分～3分者入选。

1.2.3 标本及病理切片的制备 左卡尼汀各剂量组、生理盐水对照组在缺血2 h再灌注24 h,假手术组在24 h后,颈椎脱臼处死,迅速取脑,各组随机取两只大鼠右侧脑组织迅速固定,石蜡包埋后,在海马部位做矢状切片,厚约5μm,HE染色,观察组织学变化。

1.2.4 脑组织匀浆的制备与指标的检测 将脑组织用生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,精确称重后制备10%匀浆。低温离心机将匀浆以3 500 r/min离心15 m in,取上清液检测ATP酶,严格按照试剂盒提供的步骤进行测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包,数据以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析进行统计分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下HE染色结果 假手术组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。生理对照组神经细胞变性坏死明显,胞体肿胀,周围间隙增宽,结构不清,出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。左卡尼汀各剂量组神经细胞呈轻度缺血改变,变性坏死不明显,胞体呈轻度肿胀,神经细胞缺失较生理对照组轻。

2.2 脑组织ATP酶活性的变化 与A组比较,B组3种ATP酶的活性均明显降低(P＜0.01)。C组、D组与B组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。详见表1。

表1 左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注后脑组织ATP酶活性变化的影响(±s)μmol/(m gprot◦h)

表1 左卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注后脑组织ATP酶活性变化的影响(±s)μmol/(m gprot◦h)

组别n Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase总ATPase A组6 10.266±0.993 6.501±0.538 20.569±2.059 B组6 7.258±0.5051)3.821±0.5011)14.800±1.2181)C组6 8.585±0.8151)3)5.876±0.5692)3)18.514±1.5572)3)D组6 9.075±0.7192)3)6.134±0.6673)19.370±1.7313)与A组比较,1)P＜0.01,2)P＜0.05;与B组比较,3)P＜0.01

3 讨 论

缺血性脑损伤的病因和病变机制十分复杂,其中能量耗竭被认为是缺血性神经元损伤的始动因素。脑缺血再灌注后细胞能量代谢障碍可使脑细胞内ATP逐渐耗竭,依靠ATP运转的离子泵(Na+-K+-ATPase)因能量障碍而受到抑制,同时因Na+-K+-ATPase和Ca2+-M g2+-ATPase活性降低,导致胞内Na+和Ca2+超载。细胞内Na+增多,导致渗透压升高,是再灌注早期脑细胞内水肿和神经细胞坏死的重要原因[3]。细胞内Na+增多,Na+-Ca2+交换增多,进一步加重细胞内Ca2+超载,引起自由基产生增多,使细胞膜结构破坏,细胞膜通透性增加,细胞内外环境失去平衡,最后导致神经元死亡。本研究显示,大鼠脑缺血再灌注后脑组织ATP酶活性均明显较假手术组降低(P＜0.01)。ATP酶活性被认为是神经细胞质膜功能状态的标记,其活性已成为间接反映细胞能量代谢情况及脑缺血损伤程度评价的一项重要指标。

左卡尼汀是线粒体脂肪酸β-氧化产生能量的重要辅因子,最近国外研究发现,脂肪酸也作为一个重要能量底物被大脑使用,大脑中13碳-辛酸酯(13C-octanoate)氧化产生能量几乎占大脑总能量的20%[4]。脑缺血后补充左卡尼汀可降低游离脂肪酸浓度,使堆积的脂酰CoA进入线粒体内,进行β氧化,产生ATP供能[5]。左卡尼汀能降低脑乳酸/丙酮酸比率,提高丙酮酸脱氢酶的活力,促进葡萄糖的氧化利用,改善预后的神经功能[6]。在体外神经细胞培养缺血缺氧模型中,左卡尼汀可保持呼吸链复合物的活性,提高呼吸链的代谢,保护线粒体的蛋白质,对抗线粒体氧化应激反应和调节细胞应激,促进线粒体细胞色素C氧化酶的活性,促进线粒体ATP的产生,对缺血神经细胞产生保护作用[7,8]。Alves等[9]研究表明,左卡尼汀对抗MDMA(二亚甲基双氧苯丙胺)的神经毒性作用,降低线粒体m tDNA缺失,发挥神经保护作用。

本实验研究显示,缺血前0.5 h腹腔注射左卡尼汀能使降低的ATPase活性不同程度的恢复,提示左卡尼汀提高脑组织ATP酶活性,减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的保护机制可能有:通过促进脑缺血再灌注后线粒体脂肪酸代谢,提高糖代谢,加速ATP产生,及早恢复缺血半暗区能量供应,阻断后续的链式神经元损伤反应,产生神经细胞保护作用。Na+-K+-A TPase活性升高可纠正细胞内酸中毒,Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高可纠正Ca2+超载,左卡尼汀通过提高脑缺血再灌注后Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性,维持钠泵、钙泵的稳定,使细胞内外Na+、Ca2+平衡,从而稳定神经细胞膜电位,起到神经细胞保护作用。关于左卡尼汀在神经细胞保护的其他相关机制,尚有待于进一步研究。

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