局灶性脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑红蛋白的表达及意义

刘劲睿,陈梓桂,张明石

(1.佳木斯大学附属第一医院神经外科,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学2007级研究生,黑龙江 佳木斯 154007)

近年来研究表明[1],缺血后的血流恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍,这种恢复血流灌注后的有害情况称为缺血再灌注损伤(IRI),抑制再灌注损伤成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节。缺血预处理(IP)这一概念是由 Murry[2]在1986年研究犬心肌缺血再灌注损伤实验中首次提出的,近年研究发现缺血预处理可以提高组织对缺血损伤的耐受性。本研究采用大鼠右侧大脑中动脉二次线栓法制备 SD大鼠的预缺血一再灌注一缺血一再灌注在体模型,利用 T TC染色 ,HE染色 ,免疫组织化学技术 ,观测大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间段的大脑皮质脑红蛋白变化,旨在探讨脑损伤后大脑皮质脑红蛋白随时间变化的规律,以期完善脑缺血耐受机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年 SD大鼠90只,雌雄不限,2～ 3月龄,体重 230～250g,由佳木斯大学实验动物中心提供,随机分为假手术组(A组),缺血再灌注组 (B组),预处理缺血再灌注组(C组),每组取缺血再灌注 2h、8h、 24h、 48h、 96h5个时间点 ,分成 5个亚组,每个亚组6只老鼠,共90只大鼠。

1.2 动物模型制备

本研究参照 Longa等[3]和郝玉曼等[4]线栓法改进而来的大鼠右侧大脑中动脉二次线栓法制备的 SD大鼠的预缺血一再灌注一缺血一再灌注在体模型,具体操作如下:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后,颈部正中切口,暴露颈总动脉(CCA)及分叉部,注意勿伤迷走神经 ,逐步分离颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),在颈外动脉近端备线,在颈总动脉和颈内动脉下方各穿一提拉线以暂时阻断血流,在颈外动脉结扎线近端距分叉5mm处以头皮针穿刺的方式导入直径0.235mm、长5cm尼龙丝线,插入端用火烧圆并涂以肝素后,进入 ICA约18～ 20mm,感觉有阻力时则为阻断 M CA入口,结扎 ECA近心端,去掉颈总动脉和颈内动脉下方的提拉线。10min后从 ECA轻轻抽出尼龙丝线约18～ 20mm,形成第一次再灌注 ,将线尾埋在皮下;缝合皮肤切口,完成脑缺血预处理。72h后将埋在皮下的尼龙丝线再次推入 ICA约 18～ 20mm造成 M CA阻塞(MCAO),90min后将留在皮外的尼龙丝线抽出约18～ 20mm,形成第2次再灌注。各组分别在第2次再灌注后2h,8h,24h,48h,96h评估神经功能缺损,并在相应的时间点处死大鼠取出全脑测定脑组织 N GB含量。假手术组仅暴露颈总动脉及分叉处,不插线阻断M CA。

1.3 检测指标

于相应时间点,由不了解分组情况的观察者根据 David-Petullo的行为学评价标准进行评分。评分完毕后,在相应的时间点将大鼠断头处死,取脑组织甲醛固定,将固定后的脑组织制成石蜡块连续冠状切片,分别进行 HE、TTC和免疫组织学染色。将不同方法染色的切片经脱水、透明、封片后显微镜下观察。

1.4 图像分析

每个脑组织标本选取5张切片进行图像分析,在经200倍放大的光学显微镜下,取缺血侧扣带回皮层区域进行拍照,用 Image一 J软件数出每张照片中 NGB阳性细胞的数量。

1.5 统计学处理

所有数据均以表示,用 SPSS17.0软件进行数据处理,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的行为学测试

神经肌肉运动功能评分:B组和 C组大鼠脑缺血再灌注后2h存在神经肌肉运动功能明显缺失,再灌注后不同时间点 B组评分高于 C组 (P＜0.05),B组和 C组评分均高于A组 (P＜0.05)。前庭运动功能评分与神经肌肉运动功能评分情况有所相似。

2.2 免疫组化结果

在脑缺血再灌注后2h,NB在皮质区即有大量表达,24h达到高峰后数量逐渐下降,再灌注后2h,8h,24h,48hB组和C组 NB表达数量均高于 A组 (P＜0.05)。B组和 C组在再灌注后各时间点 Ngb表达数量比较有统计学意义(P ＜ 0.05)。

表1 各组不同时间点 NGB的表达结果 ±s,n=30)

表1 各组不同时间点 NGB的表达结果 ±s,n=30)

2.3 脑组织病理改变

B组在缺血再灌注后2h缺血侧额顶部皮质和基底节区神经组织细胞排列开始出现紊乱、肿胀,各时间点脑组织均见神经元结构模糊,24h后出现不同程度的核深染,核固缩,核溶解,间质水肿 ,血管周围间隙增宽,组织坏死严重。C组神经组织细胞的核固缩、核溶解程度比缺血再灌注组明显减轻,间质水肿和血管周围间隙增宽情况较减少。

2.4 脑梗死体积测定

在再灌注后相同时间点,C组较 B组梗死体积明显减小,差异具有统计学意义 (P ＜0.05)。

3 讨论

近年的研究表明,预先短暂缺血或轻度低氧可激发或动员机体内在防护能力,对随后的严重缺血或缺氧产生强大防御和保护作用。本实验观察到,在再灌注后相同时间点,C组较 B组梗死体积明显减小,差异具有统计学意义(P＜0.05)。脑缺血预处理能减少神经功能缺损评分和缩小缺血后脑组织梗死体积比,病理形态学 HE染色检测也显示脑缺血预处理对脑再次严重缺血损伤有明显的保护作用。Burmester[5]于 2000年报道了人和小鼠的脑红蛋白,为氧这一基本生命元素与神经系统功能活动之间的关系提供了重要线索。2002年邓美玉等[6]发现大鼠大脑皮质中 N GBmRN A阳性神经元分布广泛,NGBmRN A产物定位于神经元的胞质。2004年 Laufs等[7]发现 ,NGB在神经元内特异性表达 ,而神经胶质细胞却不表达。本实验研究了大鼠脑缺血再灌注后2～96h后在各组大鼠皮层 NGB阳性神经元的表达变化情况。观察发现,在脑缺血再灌注后2h,NB在皮质区即有大量表达,24h达到高峰后数量逐渐下降。综上所述脑缺血预处理有助于脑红蛋白的表达,脑红蛋白表达升高可能对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,可能是局灶性脑缺血耐受产生的分子机制之一。所以脑缺血预处理与 NGB二者结合起来对临床脑缺氧缺血性疾病治疗提供了新的思路,对缺血性脑血管病新药的开发提供理论依据。

[1] Xu Z,Xu RX,Liu BS,et al.Time window charaeteristics of cultured rat hippocampal rat hippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion[J],Chin J Traumatol,2005,8(3):179-182

[2] Murry CE,Jennings RB,Reimer KA,et al.Preeonditioning with isehemia:a delay of lethal cell injury in isehemic myoeardium[J].Cireulation,1986,74(5):1124-1136

[3] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible widdle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

[4] 郝玉曼,罗祖明,周东.局灶性预缺血诱导脑缺血耐受的动物模型[J].中风与神经疾病杂志,2003,20(2):129-131

[5] Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et a1.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520

[6] 邓美玉,张成岗,王航雁,等.免疫组织化学方法检测脑红蛋白在大鼠中枢神经系统的分布 [J].中国组织化学与细胞化学杂志,2002,11(3):271-274

[7] Laufs T L,Wystub S,Reuss S,et a1.Neuron-specific expression of neuroglobin in mammals[J].Neurosci Let,2004,362:83-86