微小RNA-451对结肠癌细胞侵袭能力的影响

吴春蓉,李生陆,罗治彬

(1.重庆医科大学第二附属医院肿瘤科 400010;2.重庆市合川区人民医院肿瘤科 401520)

肿瘤是目前对人类生命和健康危害最严重的疾病之一。肿瘤发生、发展的确切机制仍未完全阐明,一类新的非蛋白质编码微小RNA(microRNA,miR)的出现为肿瘤研究提供了新的思路。miR是一类长约20～25个核苷酸的非编码的单链RNA分子。它通过与靶mRNA完全或不完全地互补配对,促进目标mRNA降解或抑制蛋白翻译,在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及肿瘤的发生中扮演重要的角色。研究特定miR在肿瘤发生、发展中的作用正成为肿瘤研究的一个新的热点。

2005年Altuvia等[1]首次发现 miR-451。2009年 Bandres等[2]研究发现miR-451与预后不良相关。与无瘤组织相比,原位杂交显示胃癌和结肠癌上皮细胞miR-451表达降低。胃癌细胞AGS和结肠癌上皮细胞DLD1 miR-451过表达则降低细胞扩增及增加放射敏感性。微阵列及生物信息学分析鉴别出新的致癌基因巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是miR-451的潜在靶点。而MIF是参与肿瘤侵袭、转移的重要因子[3-4]。2010年Godlewski等[5]研究miR-451表达对脑胶质瘤迁移的影响。球体实验、划痕实验及小室侵袭实验均发现miR-451降低球体迁移,深入研究发现miR-451通过影响细胞骨架而调控迁移。但miR-451是否影响胃肠癌细胞侵袭能力还未被研究。本课题将化学合成的miR-451 mimics转染结肠癌细胞系SW480细胞,观察其对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人源性结肠癌细胞株SW480(CCL-228,ATCC)为重庆医科大学张贵海博士馈赠。特级胎牛血清购自北京元亨圣马生物科技公司,新生牛血清购自杭州四季青公司,Leibovitz′s L-15培养基购自北京迈晨基因公司,转染试剂脂质体lipofectamine2000(简称lipo2000)购自美国Invitrogen公司,Opti-M EMⅠ低血清培养基购自GIBCO公司,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自碧云天生物技术研究所,人miR-451 mimics、阴性控制及Cy3标记的转染效率控制购自广州锐博公司(RiBoBio),Matrigel购自BD Bioseience公司,Transwell侵袭小室(8 μ m 孔径)购自Millipore公司,细胞培养板购自美国Costar公司。

1.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的L-15培养基培养。所有细胞均在37℃、无CO2、饱和湿度条件下传代培养,选用对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞转染 实验分组:(1)miR-451转染组,加入合成的成熟型miR-451 100 nmol/L(终浓度为100 nM)和相应剂量的脂质体;(2)Negative组,加入无关序列和脂质体;(3)脂质体组,仅加入脂质体;(4)对照组,无任何转染。

1.3.1 转染效率检测 转染前24 h接种SW480于24孔板,待生长至30%～50%汇合时,Opti-MEMⅠ释转染试剂 li-po2000,另用 Opti-M EMⅠ分别稀释不同剂量的 siR-RiboTMTransfection Control(Cy3),使转染时终浓度分别为 50、80、100、120 nM;室温孵育 5 min;将二者轻轻混合,室温培养 20 min以形成Transfection Control(Cy3)-lipo2000混合物,再加入含有细胞及培养液的24孔板中,轻晃均匀;将培养板置于37℃、CO2培养箱中培养。24 h后用荧光倒置相差显微镜检测转染情况。整个操作过程严格遵循RNA操作相关规则,并且避光。胎盘蓝染色计数活细胞数。

1.3.2 miR-451 mimics/Negative转染 转染前 24 h接种SW480于6孔板,待生长至 30%～50%汇合时,取miR-451 mimics/Negative 10 μ L 、脂质体 5 μ L,分别经 Opti-MEM 稀释至250 μ L,于室温中作用 5 min后将两者缓缓混合,静置 20 min,加入SW480中摇晃混匀。培养6 h后,换含 10%胎牛血清的1640培养液,培养24～48 h后收集细胞用于后续实验。另设单纯脂质体转染组,未转染细胞做对照组。实验重复3次。

1.4 CCK-8检测肿瘤细胞增殖能力 按照CCK-8试剂盒说明书进行。将SW480细胞按4×103个/孔接种于96孔培养板(每孔100 μ L)中,待细胞贴壁后转染,分别于转染后(24、48、72 h)加入 CCK-8 10μL,37 ℃、5%CO2培养 2 h,酶标仪测定D450值。每个处理组设4个复孔。重复3次。

1.5 miR-451 mimics对SW480细胞凋亡的影响 用流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡。转染后48 h用胰酶消化细胞,制成单细胞悬液,离心。PBS洗2次后用PBS重悬,充分吹打。调整细胞密度为1×106个/mL,加入 10 μ L Annexin V-FITC和10 μ L PI,混匀,进行流式细胞仪(BD FACS Vantage)检测。Annexin V阳性/PI阴性判断为早期凋亡,Annexin V阳性/PI阳性判断为晚期凋亡。二者合并计算细胞凋亡率。

1.6 侵袭能力检测 肿瘤细胞体外侵袭实验:用50 mg/L基质胶(BD公司)1∶4稀释液包被8 μ m 孔径 Transwell小室滤膜的上表面,于37℃、5%CO2培养箱中温育 1 h,用 L-15水化小室滤膜上、下表面。消化收集转染后24 h的细胞,离心弃去培养液,用PBS洗 1～2遍,用含0.1%BSA的 L-15培养基重悬,调整细胞密度至1×105/mL的细胞悬液。24孔板中放置Transwell侵袭小室,先在小室上层分别加入事先制备好的4组细胞悬液200 μ L,轻轻摇匀。再向下室加入600μL含 10%FBS的L-15培养液。置24孔板于 37℃、无CO2培养箱中培养。48 h后从孔板中移出小室,用脱脂棉拭去小室滤膜上层未通过微孔的细胞,将此滤膜先于 4%多聚甲醛中固定 30 min,1%结晶紫染色10 min,使侵袭到滤膜下层的细胞充分着色呈紫蓝色,轻轻洗涤残余染料,倒置显微镜观察并拍照,每组随机选择5个视野,计数。并重复实验3次。

1.7 统计学方法 所有实验重复3次,所得数据用SPSS17.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示,进行正态性分析及方差齐性检验,多组间比较应用单因素方差分析,两组间比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转染效率 随着转染剂量的增加,转染进入细胞的荧光增多,而终浓度为 100、120 nM 时,转染效率都高(约 80%～90%)(见彩插Ⅰ 图 1)。50、80、100 nM 组死细胞都极少,而120 nM组死细胞增加,提示随着转染剂量增加,细胞毒性也增加,所以选择100 nM终浓度为实验转染miR mimics/Negative的优化浓度。

2.2 miR-451 mimics对SW480增殖能力的影响 各组细胞生长曲线较为相似,增殖速度无明显差别(图2)。

图2 miR-451 mimics(100 nM)转染对SW480细胞增殖能力的影响

2.3 miR-451 mimics对SW480细胞凋亡的影响 对照组细胞凋亡率为(5.81±1.20)%,Negative组细胞凋亡率为(9.57±2.92)%,miR-451转染组细胞凋亡率为(6.33±2.89)%,脂质体组细胞凋亡率为(5.60±2.63)%。各组细胞间凋亡发生率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 细胞侵袭能力 对照组细胞具有一定的侵袭能力,48 h通过8 μ m 孔径的细胞数为(33±7)个。miR-451转染组为(17±2)个,Negative组为(29±5)个,脂质体组为(31±7)个。Negative组、脂质体组侵袭能力与对照组一致,miR-451转染组最低(见彩插Ⅰ图 3)。

3 讨 论

肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程。包括各种黏附相关分子、蛋白水解酶类、许多细胞因子及调节因子、信号转导通路分子、肿瘤侵袭转移相关基因及转移抑制相关基因和一些癌基因、抑癌基因等。miR参与对肿瘤侵袭转移相关分子的基因表达调控研究已经成为肿瘤研究的热点。在大多数高侵袭性的乳腺癌细胞系(如MDA-MB-231)中,miR-126和miR-335表达缺失,通过逆转录病毒转导的方法恢复miR-126或miR-335的表达可以使癌细胞的转移活性减少80%。Tavazoie等[6]证明细胞形态的改变与减少细胞运动性有关,它限制细胞的侵袭转移。miR-335负调控组与肿瘤远端转移相关的靶基因,这些靶基因为祖细胞转录因子SOX4和细胞外基质成分钙黏蛋白C。Ma等[7]证明 miR-10b的表达与肿瘤的血管侵袭有关,同时miR-10b特异性增加肿瘤细胞的侵袭,但不影响细胞的生活力和增殖。将过表达miR-10b的乳腺癌细胞系SUMl59注射到小鼠乳房脂肪细胞中可以观察到肿瘤细胞簇的肺部微小转移,并有部分细胞转移到胸膜。Sengupta等[8]应用芯片技术发现miR-29c在鼻咽癌中的表达是正常鼻咽组织的1/5。进一步研究表明,miR-29c调控的基因为细胞外基质蛋白,包括胶原和层粘连蛋白γ1,它们参与鼻咽癌的侵袭转移。miR与肝癌侵袭转移的研究也备受关注[9]。影响结肠癌预后的主要因素为结肠癌的侵袭转移情况,因此研究与结肠癌侵袭及转移密切相关的特定miR具有重要意义。

miR-451是一个多功能miR,已被发现在多种恶性肿瘤中发挥重要作用。最近研究表明,miR-451具有不同的功能,在多种生理和病理过程中(如造血系统分化[10]、血液系统疾病[11]、神经发育[12]、心血管疾病[13]、癌症发生等)起重要作用。实验表明,miR-451在多种恶性肿瘤中(如胶质母细胞瘤[14]、胃肠癌[2]、头颈部鳞状细胞癌[15]等)异常表达,miR-451还通过靶向MDR调控卵巢癌[16]、乳腺癌[17]耐药。

但此前尚未有miR-451与胃肠癌侵袭具有相关性的报道。2010年Godlewski等[5]研究了miR-451表达对脑胶质瘤迁移的影响。球体实验、划痕实验及小室侵袭实验均发现miR-451降低球体迁移,深入研究发现miR-451通过影响细胞骨架而调控迁移。生物信息学方法预测及荧光素酶实验证实胶质瘤细胞中CAB39是miR-451的一个功能相关靶标。提示miR-451也有可能在胃肠癌的侵袭及转移中扮演重要角色。因此,本研究对miR-451的功能进行了进一步的研究,通过功能检测发现,miR-451的表达能够抑制SW480的侵袭能力。

作者使用siR-RiboTMTransfection Control(Cy3)作为转染效率判断的间接指标,其与hsa-miR-451 mimics片段大小相似,但是带Cy3荧光基团,在相同的操作条件下,检测不同浓度下的转染效率,便于实验转染mimics筛选有效剂量,mimics组及negative组未带荧光基团,主要考虑后续实验中如流式检测会带来干扰。本研究结果显示,随着转染剂量的增加,转染进入细胞的荧光增多,而终浓度为100、120 nM 时,转染效率都高(约80%～90%)。而120 nM时细胞毒性增加,作者选择100 nM作为实验优化剂量。

miR mimics是运用化学方法合成的miR模拟物,能模拟细胞中miR的高表达水平,进一步增强内源miR的调控作用,进行功能获得性(gain-of-function)研究。本研究通过直接瞬时转染miR mimics对miR-451的功能进行检测,这种方法的优点在于化学合成miR简单、快捷,避免了构建表达载体的步骤,能够有效提高特定miR的表达,但缺点是增强表达的持续时间较短,而且转染后表达量到底增高多少、能持续多久,还有待于荧光定量PCR检测。因此,miR-451转染后对细胞增殖和凋亡无影响的实验结果尚不能肯定是miR-451确实对SW480细胞增殖和凋亡无影响,还是miR-451表达量太低所致,尚有待于进一步探讨。

综上所述,本实验利用miR转染技术提高miR-451在转染细胞中的表达;采用Transwell实验发现提高miR-451的表达能够抑制SW480细胞的侵袭能力。首次发现了miR-451在结肠癌细胞系SW480的侵袭转移中发挥重要作用,为miR作为靶向肿瘤基因治疗的新靶点提供了重要的实验依据。但miR-451是通过靶向哪个或者哪些基因而调控侵袭能力的尚有待于更进一步的探讨。对miR及其调控网络的深入理解,以及对miR功能和相关靶位点的全面阐明必将给未来miR在肿瘤临床、诊断和治疗中的应用带来广阔前景。

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