甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

叶文兴, 徐秉良, 彭德良, 黄文坤

(1.甘肃农业大学草业学院,兰州 730070;2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber,1924,cereal cyst nematode,CCN)是温带禾谷类作物上的世界性重要病原线虫,最早于1874年Kühn在德国发现,随后在英国、俄罗斯、挪威、澳大利亚、加拿大、日本、印度、美国、新西兰、中国等40多个国家发生危害,严重影响禾谷类作物尤其是麦类作物的产量和质量。自1989年我国首次在湖北天门县发现禾谷孢囊线虫危害小麦后[1-2],目前已发现在河北、河南、北京、山西、内蒙古、青海、湖北、安徽、山东等11省市都有CCN的分布,CCN已成为严重威胁我国小麦生产的主要病害[3-5]。

随着分子诊断技术的快速发展,已探索出许多线虫种群分类鉴定的分子诊断方法,利用分子技术探索不同种群 rDNA-ITS和 rDNA 28S的D2/D3区的序列特征已成为近年来线虫分子诊断的研究热点。28S是核糖体大亚基rRNA的转录基因,28S的D2/D3区是 rDNA中进化最快的一个编码区,具有高度保守的序列将其分割,能够在种的水平上进行种间的分子鉴别[6]。Subbotin等[7]从28S rDNA-D2/D3区分析了垫刃目(Ty lenchida)线虫在亚目、科、种系统发育中与其他种群的亲缘关系。李佳等[8]对香蕉穿孔线虫 rRNA基因的D2/D3区序列进行了分析,蒋立琴等[9]也成功地利用 28S rDNA-D2/D3区特征将伞滑刃线虫属部分种群进行区分,所以,D2/D 3区常常用于研究不同地理来源的不同线虫种间的遗传多样性[10]。同样,rDNA-ITS区序列和 ITS-PCR-RLFP图谱也能够有效地区分和鉴别线虫种间的亲缘关系和遗传特征。ITS序列是一个多用途的遗传标记,位于18S和28S核糖体DNA基因的重复簇之间,中间被5.8S核糖体DNA基因分开[11]。Subbotin等[12]扩增了5种孢嚢线虫rDNA的28S基因的D3扩展区和ITS1-5.8S-ITS2区,结果发现 G.rostochiensis和G.pallida D3扩展区的核苷酸序列相同,并用RFLP分析成功区分了来自南美茄科植物上的3种孢嚢线虫 G.rostochiensis、G.tabacum、G.pallida和1个未描述的种,同时构建了遗传上亲缘关系的系统发育树。Ferris等[13]分析来自俄国H.filip jevi群体的rDNA-ITS序列,证实俄国不同地区的 H.filip jevi基因一致,与瑞典的 H.avenae相似性达到99.7%,支持了瑞典的H.filip jevi和 H.avenae是近缘种,同时也提示形态相似,地理隔离的群体有可能是同属种。在RFLP图谱分析中,有时限制性片段长度的总和大于没有酶切的阳性对照扩增产物,这说明禾谷孢囊线虫群体的ITS区域存在异质性[14]。Subbotin等[15]对来自世界多个国家和地区的禾谷孢囊线虫群体 rDNA中ITS区的PCR-RFLP分析,发现了ITS有异质性,命名为 ITS“A”型和 ITS“B”型。郑经武等[16]对来自山西太谷的禾谷孢囊线虫群体与国外上述两种ITS型群体rDNA中ITS区的PCR-RFLP比较分析,发现中国禾谷孢囊群体的ITS特征系是一个新的类型“C”型,用 H in fI和 Tru9 I可将中国禾谷孢囊线虫与其他禾谷孢囊线虫分开。彭德良等[17]用 H in fⅠ、AluⅠ和 RsaⅠ将中国禾谷孢囊线虫和摩洛哥禾谷孢囊线虫群体存在差异,AvaⅠ和H in dⅢ2种限制性内切酶不能酶切禾谷孢囊线虫的ITS产物。

本研究应用PCR技术对采自甘肃6个市县的7个禾谷孢囊线虫群体和1个河南群体、1个安徽群体的28S rDNA-D2/D3区和ITS区进行了序列特征分析,并对甘肃禾谷孢囊线虫 ITS区进行了RLFP图谱分析,以揭示甘肃省内不同地理种群间的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 禾谷孢囊线虫孢囊的分离方法

在2009年2月和 6月,从甘肃省文县、天水、甘谷、榆中、武威、民勤以及河南省安阳县和安徽省蚌埠市等8个县市(表1)采集受害的小麦根及根际土壤,取200 g土壤在小桶容器中使土块分散,用强水流冲洗,用木棍搅动,沉淀片刻后,将水溶液通过20目和60目的样品筛,重复以上步骤3次,用小水流轻轻清洗60目筛残余物,将其60目筛中残余物淋洗到三角瓶中,用滤纸过滤,在解剖镜下挑取饱满可育的孢囊冷藏备用[17]。

1.2 禾谷孢嚢线虫DNA的提取

挑取1个饱满的孢囊,放入灭菌的Eppendorf管中,加入14μL灭菌的重蒸水,在液氮中速冻1min取出。用75%乙醇消毒的玻璃棒在Eppendorf管中转动至冰融化,使孢囊破碎研磨1 min后加入3μL的10×PCR buffer(Promega,USA)和3μL蛋白酶 K溶液(600mg/ML)(TaKaRa,Biotech),然后在-20℃下冷冻至少2 h。之后,将Eppendorf管从冰箱中取出,置65℃下温育1.5 h;接着在95℃10min,使蛋白酶K变性,最后12 000 r/min下离心1 min,取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用[17]。

表1 禾谷孢嚢线虫采样及注册的ITS和D2/D3序列

1.3 28S rDNA D2/D3区域PCR扩增

本研究采用 50μL的 PCR反应体系,10×PCR-buffer(含 Mg2+)5.0 μL,dNTPs 4 μL,引物D2A 1.5μL,引物 D3B 1.5μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4μL,模板DNA 5.0 μL,灭菌重蒸水补足到50μL,同时设置无DNA模板的阴性对照。试验所用的引物为 D2A(ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG)和D3B(TCGGAAGGAACCAGCTACTA)[18-20]。在 Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4Min,94℃30s,55℃45s,72℃2 min,循环35次,72℃延伸10 min后保存在4℃条件下。取5μL扩增产物加1μL 6×Loading buffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用0.5×TAE作为电泳缓冲液,100 V下电泳45 Min,用EB染色,用BIO-RAD成像仪在紫光灯下观测并照相。

1.4 28S rDNA D2/D3区域PCR产物的克隆、测序和序列分析

将PCR产物进行回收纯化,纯化后的产物与pGEM-T easy vector连接12 h,然后转入感受态细胞DH 5a中,用热击法进行转化后涂在含有Ampicillin(100 Mg/L)、IPTG(24 mg/L)和 X-gal(200mg/L)的 LB培养基平板上,涂匀后倒置入37℃培养箱中12～16 h,进行蓝白斑筛选。挑取单个白斑于含有Ampicillin(100 mg/L)的液体 LB中摇培过夜,经菌落PCR鉴定后,将含有正确片段的菌液进行测序。所得序列用 Chromas、DNAMAN分析比对,在GenBank注册,并在NCBI下载已知近缘种序列,用MEGA 4.0中的UPGMA法构建禾谷孢囊线虫群体的系统发育树,进行亲缘关系分析。

1.5 rDNA-ITS的PCR扩增

本研究采用 50μL的PCR反应体系,10×PCR-buffer(含 Mg2+)5.0 μL,dNTPs 4 μL,引物TW 81 0.3μL,引物 AB28 0.3μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4μL,模板DNA 3.0 μL,灭菌重蒸水补足到50μL,同时设置无DNA模板的阴性对照。试验所用的引物为 TW 81(GTTTCCGTAGGTGAACCTGC)和AB28(A TATGCTTAAGTTCAGCGGGT)[21]。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5Min,94℃45s,55℃1 min,72℃2Min,循环35次,72℃延伸10 min后保存在4℃条件下。取5μL扩增产物加1μL 6×Loading bu ffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用 0.5×TAE作为电泳缓冲液,100 V下电泳45Min,用EB染色,用BIO-RAD成像仪在紫光灯下观测并照相。

1.6 ITS的PCR扩增产物的克隆、测序和序列分析

PCR产物的回收纯化、连接、转化、测序等方法与上述方法相同,所得序列在GenBank注册,并在NCBI下载已知近缘种序列,用 MEGA 4.0进行UPGMA聚类分析。

1.7 ITS-RFLP分析

分别取5μL纯化后的PCR产物用9种限制性内切酶 AluⅠ 、AvaⅠ 、Bsh1236Ⅰ 、Bsu RⅠ 、C foⅠ 、Hin fⅠ、RsaⅠ、TaqⅠ和 MvaⅠ酶切。AluⅠ 、AvaⅠ、Bsh1236 Ⅰ、Bsu R Ⅰ、C fo Ⅰ 、H in fⅠ 、Rsa Ⅰ、MvaⅠ在37℃水浴中16 h,Taq I在65℃水浴16 h。酶切后的DNA加1μL 10×Loading buffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用0.5×TAE作为电泳缓冲液,90 V下电泳1.5 h,用EB染色,用BIORAD成像仪在紫外光下观测和照相。

2 结果与分析

2.1 28S rDNA D2/D3区域和rDNA-ITS的PCR扩增结果

经PCR扩增的禾谷孢嚢线虫28S rDNA的D2/D3区和ITS区序列,扩增片段长度分别约为780 bp(图1)和1 040 bp(图2)。序列测定结果表明,GsWx、GsMq、GsTs1、HnAy1、GsYz、AhBb、GsTs2 7个禾谷孢囊线虫群体的D2/D3区的序列长度为782 bp,G sGg、G sWw 2个禾谷孢囊线虫群体D2/D3区序列长度为784 bp;这9个禾谷孢囊线虫的ITS区的序列长度都是1 045 bp,将所测的禾谷孢囊线虫D2/D3区和 ITS区序列在GenBank上注册,得到了9个序列注册号(表1)。

图1 9个禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)28S rDNA-D2/D3区扩增产物

图2 9个禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)rDNA-ITS扩增产物

2.2 序列分析结果

2.2.1 28S rDNA-D2/D3区序列分析和聚类分析

用DNAMAN软件对比这9个禾谷孢囊线虫的D2/D3区的序列,其序列的一致性达99.77%,其中GsGg与GsWw种群的序列没有差异,比其他7个群体的序列在第136、137两个位点插入2个碱基(T和C);GsTs1群体在第284位点、GsYz群体的第331位点有碱基的替换 ;G sW x、GsWq、GsTs2、A h-Bb1、HnAy1 5个群体的序列无差异。这表明在甘肃禾谷孢囊线虫群体间D2/D3区的一致性很高、具有很高的保守性。

通过NCBI中的BLAST比对分析,将本研究中所涉及的9个禾谷孢囊线虫群体的D2/D3序列与GenBank中下载的孢囊属(Heterodera)、球形孢囊属(Globodera)、棘皮属(Cactodera)的13个群体的D2/D3序列进行比对分析,用UPGMA方法构建了系统发育树(图3)。从图3中可以看出,在遗传距离为0.02的水平上,可分为3类：第1类有GsW x、GsMq、G sTs1、H nAy1、GsYz、AhBb1 、G sTs2、Gs-Gg、GsWw 、新西兰的 H.auck landica(DQ328688)和 H.litoralis(DQ328691)、叙利亚的H.latipons(DQ328687)、印度的 H.sorghi(DQ328689)、比利时的 H.salixophila(DQ328690)、美国的 H.glycines(DQ328692)15个群体,其中7个甘肃禾谷孢囊线虫群体与 HnAy1、A hBb1、新西兰的 H.aucklandica(DQ328688)为同一组群,遗传距离很小,并且与叙利亚的H.latipons(DQ328687)有着96%的置信度;第2类有德国的C.cacti(DQ328702)、波兰的G.pallida(EU855119)和G.rostochiensis(EU-855120)、荷兰的 G.pa llida(AY 592992)、美国的G.tabacum(GQ294492)5个群体,棘皮属和球形孢囊属的遗传距离比较接近;第3类有比利时的H.urticae(DQ328696)、德国的 H.goetting iana(DQ-328697)2个群体,这2个群体之间的遗传距离小于0.01,置信度在100%。D2D3区的系统发育树表明孢囊属、球形孢囊属、棘皮属之间有着较近的遗传关系,在孢囊属有两个大的分支,这些遗传特征之间的差异与寄主有着密切的关系,孢囊属在禾谷类寄主和豆科类寄主就存在明显差异,不同寄主间有小种的分化,但在不同属之间又有着近缘关系。

图3 用UPGM方法构建的28S rDNA-D2/D3区的系统发育树

2.2.2 rDNA-ITS区序列分析和聚类分析

用DNAMAN比对后的结果为：禾谷孢囊线虫rDNA-ITS区仅在第620和第897位点有碱基替换,序列的一致性达99.9%。在NCBI上用BLAST比对分析后,在GenBank下载与本研究9个禾谷孢囊线虫有近缘关系的16个群体,包括Avenae组的有效种有澳大利亚的 H.australis(AY148395)、中国(AY 148382)、法国(AY 148374)、德国(AY148360)、以色列(AY 148366)、印度(AF274397)的 H.avenae、德国的 H.Mani(AY148377)和 H.p ratensis(AY 148383)、美国的 H.filip jevi(GU 079654)、英国的H.arenaria(AF274396);Schachtii组有伊朗的 H.glycines(AF498387)、比利时的 H.schachtii(AY 166438);Goettingiana组的有德国的H.goettingiana(AF274414)、荷 兰的 H.cruciferae(AF274411)、意大利的 H.carotae(AY 347917);还有比利时的H.urticae(AF274412)。用MEGA 4.0的UPGMA方法构建ITS区的系统发育树,其遗传距离为0.05(图4)。在图4中,本研究的9个禾谷孢囊线虫群体和在GenBank下载的16个孢囊线虫群体可分为3类：本研究中的9个禾谷孢囊线虫群体与上述Avenae组的10个群体为一类,这19个群体间的遗传距离很小,除美国的 H.filip jevi(GU 079654)群体外,其余18个群体很接近,其中澳大利亚的H.australis(AY148395)群体与中国通州的H.avenae(AY148382)和本研究的9个群体可分为同一组群;很明显,伊朗的 H.glycines(AF498387)、比利时的H.schachtii(AY166438)为一类,其置信度为100;Goettingiana组3个群体和比利时的 H.urticae(AF27-4412)为一类。这3类群体中,Avenae组与其余2类群体存在明显的异质性,在同寄主群体间存在地域和寄主对群体分化的影响。

2.3 ITS-RFLP分析

用9种限制性内切酶酶切7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS扩增产物后,共产生22个清晰可见的酶切片段(图5)。用 AluⅠ酶切7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS扩增产物,均产生2个相同的560 bp和480 bp RFLP片段(图5a);C foⅠ酶切后,7个群体均产生相同的3个 750、160、110 bp的 RFLP 片段(图 5b);Bsh1236Ⅰ酶切后产生900 bp和140 bp的2个片段分布都相同(图5c);AvaⅠ不能酶切这7个甘肃禾谷孢囊线虫的rDNA-ITS产物(图5d);RsaⅠ酶酶切后产生相同的2个720 bp和320 bp的片段(图5e);Bsu RⅠ酶切片段产生的3个RFLP分布图均相同,片段为 480、380 bp和180 bp(图 5f);H in fⅠ酶切产生 2个相同的860 bp和180 bp的片段,由于酶切效率低,有未切完全的残留片段(1 040 bp)(图5g);MvaⅠ酶切后产生的3个片段也相同,分别是420、330 bp和290 bp(图5h);TaqⅠ产生4个均相同的400、280、140 bp和 130 bp的 RFLP片段(图 5i)。

图4 用UPGM方法构建的rDNA-ITS区的系统发育树

图5 用9种酶酶切7个甘肃禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)群体

3 结论与讨论

本研究通过对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体和HnAy1、AhBb1群体的28S rDNA-D2/D3区的序列特征分析发现,7个甘肃禾谷孢囊线虫群体和HnAy1、AhBb1群体的28S rDNA-D2/D3区都具有相同的保守性,在序列特征上只有2个碱基的插入(GsGg、GsWw)和 2个位点的碱基替换,序列差异很小,序列的一致性达99.8%。构建的28S rDNAD2/D3区系统发育树将 GsWx、GsMq、GsTs1、HnAy1 、GsYz、AhBb1 、GsTs2 、GsGg 、GsWw 9 个群体归为同一分支,同新西兰的 H.auck landica(DQ328688)有着很近的亲缘关系。

分析rDNA-ITS区的序列和RFLP图谱,对孢囊线虫种的鉴定和近缘种辨别有着重要的意义。Subbotin等[22]研究了70个H.avenae复合种群的ITS序列和RFLP图谱,构建了H.avenae复合种群的系统关系,揭示出H.avenae是一个并系分类群,中国禾谷孢囊线虫不同于其他的 H.avenae群体。本研究中的 GsW x、GsMq、GsTs1、HnAy1、GsYz、AhBb1、GsTs2、GsGg、GsWw 9 个群体与澳大利亚的 H.australis(AY 148395)、中国的 H.avenae(AY 148382)为同一分支(图4),与欧洲和印度的H.avenae或A venae复合种群的其他群体相比较,其遗传距离最为接近。所以,可以在分子水平上诊断出7个甘肃禾谷孢囊线虫群体都在A venae组,且与美国的H.filip jevi(GU079654)有明显的差异。同时,在种群的分化上存在地域差异的影响,ITS-RFLP图谱分析可以直观地鉴别种内和种间的异质性,有利于群体间的遗传多态性的研究。Subbotin等[15]从禾谷孢囊线虫群体中的ITS检测到的两种不同的单元型,称之为“A 型”和“B型”,“A 型”不能被 AluⅠ和RsaⅠ这两种酶酶切,而“B型”能被A luⅠ酶切成2个片段(560 bp和500 bp),被RsaⅠ酶切产生720、320 bp 2个片段,因此,AluⅠ和RsaⅠ是区分禾谷孢囊线虫“A型”和“B型”这两单元型的主要限制性内切酶[23],并且在欧洲禾谷孢囊线虫群体中以ITS“A型”为典型,而在印度禾谷孢囊线虫中是以“B型”为典型的。Zheng等[16]发现 H in fⅠ酶切中国禾谷孢囊线虫群体后产生的图谱与“A型”和“B型”存在异质性,将其划分为“C型”,AvaⅠ则不能酶切禾谷孢囊线虫群体。用Bsu RⅠ、TaqⅠ可把 H.avenae和H.filip jevi群体分离出[15],C foⅠ可以将H.ciceri与其他群体分开,MvaⅠ和Bsh1236Ⅰ可以把 H.hordecalis分离出来。本研究的ITS-RFLP结果表明,7个甘肃禾谷孢囊线虫群体均能被 A luⅠ、RsaⅠ和H in fⅠ酶切,并且酶切结果与H.avenae“C型”完全一致。本文中的9种酶切结果与所知文献完全相符[15-23]。综上所述,甘肃的这7个禾谷孢囊线虫群体应为禾谷孢囊线虫(H.avenae),ITS-RFLP的图谱特征应为“C型”。

通过对9种禾谷孢囊线虫的28S rDNA-D2/D3区和ITS区序列以及ITS-RFLP分布型的比较分析,反映了禾谷孢囊线虫种群间和种群内的遗传学关系。甘肃禾谷孢囊线虫种群内的遗传距离很小,虽然在个别群体(GsGg、GsWw)上有几个碱基的插入或替换,这并不能影响种群内部归类分析,因为根据rDNA基因建立的系统发育树仅仅是一个基因树,和物种树可能还存在差别[9]。基因的分化时间可能早于物种的分化时间,基因树的拓扑结构可能不同于物种树。因此,把传统的形态分类特征、28S rDNA-D2/D3区和ITS区以及 RFLP图谱特征相结合,对于禾谷孢囊线虫的分类鉴定会更加有效。利用28S rDNA-D2/D3区的保守性和ITS区的稳定性,在相关的区段设计特异性引物进行PCR扩增,可用于禾谷孢囊线虫的检疫、分类鉴定和系统学研究中的特异性分子检测。

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