H22荷瘤小鼠下丘脑一致上调和下调的基因*

颜 彦，方肇勤△，刘小美，潘志强，卢文丽，梁 超，吴中华，高必峰

(1.上海中医药大学基础医学院，上海 201203;2.科罗拉多大学医学院，美国丹佛 CO 80262)

我们前期通过业已建立的小鼠四诊工作站及其系列标准[1～4]，对 H22荷瘤小鼠进行辨证，筛选出早期邪毒壅盛证、气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证等3个阶段4个常见证型，继而采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array基因芯片对上述4种证型小鼠下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤等8种组织进行检测。发现在肿瘤发生后，这些组织出现大量的基因表达和剪接差异。本文重在关注肿瘤发生后下丘脑在3阶段4个证候中一致上调或下调且至少有1个证候表达量大于1000的基因，共30个。

1 材料

1.1 动物

昆明种雄性小鼠250只，体重25g±1g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2003-0003。

1.2 试剂与仪器

Trizol试剂和RNeasy Mini Kit试剂盒分别购自美国GIBCO BRC和德国QIAGEN公司，RNA Nano LabChip及其配套的 Agilent-bioanalizer2100。GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其试剂盒(2006年)。四诊计量化检测设备见相关文献[2];芯片检测仪器包括杂交炉、芯片洗涤系统、芯片扫描仪等均购自美国Affymetrix公司。

2 方法

2.1 分组及处理

随机取60只作正常对照，另190只腋下接种H22肿瘤腹水癌细胞0.2ml(浓度4×107个/ml)，出瘤后淘汰40只出瘤不佳及畸形小鼠，剩余150只。取正常小鼠20只及荷瘤小鼠150只，共计170只用于四诊计量检测和辨证，另40只正常对照小鼠不做四诊检测，常规饲养。

2.2 四诊计量化检测方法与计量辨证方法

参见有关文献[1～3]。

2.3 荷瘤小鼠分期与常见证候的确定

依据以往的研究，H22荷瘤小鼠分期标准参见有关文献[4]。分别于接种肿瘤后第7天(早期)、第20天(中期)、第28天(中晚期)进行全体小鼠四诊检测与辨证。并分别于检测后的次日，即接种肿瘤后第8天(早期)，辨证并筛选出最为典型的邪毒壅盛、气虚证候小鼠各16只;第21天(中期)辨证并筛选出最为典型的阳气虚证候小鼠16只;第29天(中晚期)辨证并筛选出最为典型的气阴阳虚证候小鼠16只。

2.4 不同证候荷瘤小鼠的处死与取材

在小鼠四诊检测与辨证的次日，即分别于接种肿瘤后第8天，处死邪毒壅盛、气虚证荷瘤小鼠，以及正常对照小鼠各16只;第21天处死阳气虚荷瘤小鼠和正常对照小鼠各16只，第29天处死气阴阳虚荷瘤小鼠和正常对照小鼠各16只，分别取下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤组织，称重和计算各组织与正常对照小鼠对应组织重量均数的比值。

2.5 RNA的提取与检测

以上共5组样本采用Trizol(GIBCO BRC)试剂盒及其方法，抽提以上组织总RNA，16个组织样本合并混匀;采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)试剂盒及其方法纯化RNA;采用RNA Nano LabChip和方法，及其配套的Agilent-bioanalizer2100检测RNA的质量和电泳图谱。

2.6 芯片检测

采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其试剂盒所建议的检测方法。依据检测结果和Affymetrix建议的方法，采用iterPlier法计算核心基因表达读数值以及外显子剪接差异分析。以上RNA检测和芯片检测委托上海生物芯片有限公司完成。

2.7 下丘脑在3阶段4个证候中一致上调或下调且至少有1个证候表达量大于1000的基因的筛选

(1)选取5组(正常和4个证候组)表达量至少有1组≥432(5组所有基因表达的均数)的基因，共6035个，此步骤保证初步表达量;(2)筛选4个证候与正常组比值至少有1组大于或等于1.5，以及小于或等于0.67的基因，共2109个;(3)筛选一致上调的基因:4个证候与正常组比值一致大于1.5，且至少有1个证候大于1000的基因;(4)筛选一致下调的基因:4个证候与正常组比值一致小于0.67的基因。

2.8 基因信息查询

中文搜索CNKI、VIP等数据库，英文主要参考NCBI数据库中的 PubMed、OMIM、OMIA等收载的文献。

3 结果

3.1 分期处死的荷瘤小鼠

整个实验期间，先后分3阶段处死4个不同证候荷瘤小鼠计64只，即肿瘤早期的“邪毒壅盛证”、“气虚证”，中期的“阳气虚证”(气虚兼有阳虚)和中晚期的“气阴阳虚”兼证各16只。实验中自然死亡32只，尚存活54只，并涉及一些其他复合证。

3.2 荷瘤小鼠下丘脑差异表达的基因数

荷瘤小鼠下丘脑一致上调且至少有1个证候大于1000的基因共27个，其中气虚证表达最大的11个，阳气虚证表达最大的1个，气阴阳虚证表达量最大的15个，一致下调的基因共3个。

3.3 荷瘤小鼠下丘脑一致上调的基因

3.3.1 荷瘤小鼠早期气虚证下丘脑表达上调的基因 表1显示，荷瘤小鼠早期气虚证下丘脑表达上调且芯片读数计算值大于1000的基因共11个。

Lphn1为 7TM-受体外缘凝集素样结构域。7TM-受体被认为是信号传输过程中的信号转换器，参与信号转导。对拉特罗毒素有强吸引，可引发大规模神经元和神经内分泌细胞的胞吐作用。有报道认为其可能与胞吐调节有关，具体机制不详[5]。

Ctxn1在前脑发育过程中调节皮质神经元的细胞内外信号传递。

Syn1是突触蛋白家族成员，人类补体旁路途径的正调节物，分布在突触膜泡和突触小泡的细胞质表面，与细胞骨架相结合，参与突触传递和神经递质分泌的调节，对突触功能障碍和衰老过程中神经细胞的生存有重要影响。Syn1的细胞缺失会导致抑郁与癫痫[6]。

Ttyh3与氯离子通道有关。编码蛋白质的功能是钙离子激活大量氯离子通道进行信息传递。

Npcd是带有染色质域的神经元五聚环蛋白，主要存在于细胞体、凸起以及生长锥中，与神经元的质膜内侧相关，Npcd可能与轴突生长或导向有关，可影响神经生长因子，诱导神经细胞分化[7]。

Nr1d1是核受体亚家族成员，参与和调控基因转录过程，通过影响生物节律来调节代谢，对调节血脂、核脂蛋白代谢、脂肪形成和血管炎症有重要作用[8]。

表1 荷瘤小鼠早期气虚证下丘脑表达上调的基因(芯片读数计算值)

Nt5dc3能选择性地与核苷酸相互作用，形成核糖核蛋白复合物，可能参与RNA的转录和翻译，具体功能未见文献报道。

C530028O21Rik的功能不清楚。

CD74可通过影响MHCⅡ类抗原分子多肽的组装及其基因的表达，在抗原呈递过程中发挥重要作用。研究显示，细胞表面CD74可控制成熟B细胞的存活率[9]。CD74表达量增加，提示机体的免疫机能可能较活跃。

Nfix在病毒和细胞的启动因子和复制起始区中识别和结合回文序列 5′-TTGGCNNNNNGCCAA-3′，这些蛋白单独能够激活转录和复制。对维持大脑发育和神经干细胞稳态有重要作用[10]。

Mast3是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，研究表明该基因与大脑神经活动密切相关，传递信息。有研究显示，其在海马样癫痫中表达量上升[11]。

以上 Ctxn1、Lphn1、Npcd、Syn1、Mast3、Ttyh3 均与细胞特别是神经细胞的信号传递有关，Nfix、Nr1d1、Nt5dc3与基因的转录和翻译有关，CD74与机体的免疫功能有关。肿瘤发生后，4个常见证候荷瘤小鼠下丘脑的这些基因一致上调，其中又以气虚证表达量最高，提示荷瘤小鼠下丘脑内神经细胞间相互作用增强，以早期的气虚证为甚。下丘脑的一些神经元既能分泌激素(神经激素)，具有内分泌细胞的作用;又保持典型神经细胞的功能，可合成调节腺垂体激素分泌的肽类物质。这些肽类物质合成后必须经轴突运输到正中隆起，由此经垂体门脉系统到达腺垂体，促进或抑制某种腺垂体激素的分泌。由以上结果推测肿瘤发生后下丘脑的内分泌功能可能有所增强，以气虚证为甚。但具体到哪种激素?促进性或抑制性激素哪个占优势，尚待进一步分析。

3.3.2 荷瘤小鼠中期阳气虚证下丘脑表达上调的基因 表2显示，荷瘤小鼠中期阳气虚证下丘脑表达上调且芯片读数计算值大于1000的基因仅1个。

Dusp8分布在细胞核和细胞质，参与抑制促分裂素原活化蛋白激酶和蛋白氨基酸去磷酸化过程。小鼠主要在脑部和肺有表达。Nesbit等用荧光原位杂交方法发现，Dusp8杂合子丢失可导致肿瘤发生[12]。

3.3.3 荷瘤小鼠中晚期气阴阳虚证下丘脑表达上调的基因 表3显示，荷瘤小鼠中晚期气阴阳虚证下丘脑表达上调且芯片读数计算值大于1000的基因共15个。

Ptms分布在细胞核中，与细胞周期、DNA复制、细胞防御应答和发育有关，可以通过阻断胸腺旁腺素α抵制某些机会性感染来达到调节免疫功能的目的。

Eif3s5和Eif5a均与蛋白质的合成有关。Eif5a参与真核细胞翻译起始过程。研究显示，Eif5a只参与翻译后合成多胺源性氨基酸，也与蛋白质的合成有一定关系。Eif3s5则参与蛋白生物合成和调控翻译启动[13]。

S100a8分布在胞外区，与钙离子结合参与炎症应答。S100蛋白广泛存在于细胞的细胞质和/或核中，并参与调节一些细胞过程如细胞周期和分化。正常小鼠以及早期荷瘤小鼠下丘脑S100a8的表达几乎关闭，中期、中晚期表达突然持续大幅上升，这与此基因在垂体的表达趋势一致，提示荷瘤小鼠中期和中晚期可能出现一些炎症反应[14]。

Ap1g2和Ap2a1主要分布在细胞质的高尔基堆叠、衣被小凹等，参与蛋白复合体组装、细胞内蛋白运输、胞吞等过程，主要参与蛋白合成。

Syt3分布在突触膜泡和突触间，参与运输转运蛋白和钙离子结合，在运输和胞吐过程中穿过Ca2+和磷脂结合的C2域或作为Ca2+的传感器。

表3 荷瘤小鼠中晚期气阴阳虚证下丘脑表达上调的基因(芯片读数计算值)

Lcn2是脂钙蛋白的一种，分布在可溶片断和细胞质中，参与运输脂类转运蛋白。也有研究发现，Lcn2可通过与细菌铁载体结合以阻止细胞生长来影响细菌感染的先天免疫应答。

Sez6是脑特异性蛋白，可在细胞间的识别和神经元膜信号传递中发挥作用，在树突复杂结构的信息加工过程中，对平衡树突延伸段和分支起到重要的作用，参与正向刺激突触连接，与癫痫发作有关。

Atn1分布在细胞核和细胞质中，参与中枢神经系统发育，引起的病变为齿状核红核苍白球吕伊斯体萎缩(一种罕见的神经退行性疾病，包括小脑性共济失调、肌阵挛性癫痫、舞蹈手足徐动症及老年痴呆症)。

Laptm5是溶酶体蛋白质，通过抑制T细胞表面抗原受体来调节免疫应答，以控制表面受体的表达和T细胞活化。

P140在小鼠主要在脑部、睾丸、肺、肾等组织表达，在细胞黏附于纤维蛋白的早期阶段延迟细胞扩散，并与嗜铬细胞瘤细胞系的钙依赖性胞吐作用有关。

Bat2是关联转录物，定位于肿瘤坏死因子α和β。此基因包含在人类主要组织相容性复合物Ⅲ类中，调节前体mRNA剪接，是免疫系统的介体。这种基因微卫星与胰岛素依赖型糖尿病的发病年龄相关，并被认为可能在胰岛素依赖型糖尿病发展过程中参与了炎症过程中胰岛β细胞的破坏。

BC033915和LOC620583的功能不清楚。

以上Bat2、S100a8与炎症的发生有关，Laptm5、Ptms、Lcn2 均与免疫抑制有关，Sez6、Atn1、Syt3、P140与神经的发育以及神经间的信号传递有关，Eif5a、Eif3s5、Ap1g2、Ap2a1 与蛋白质的合成和运输有关。肿瘤发生后，荷瘤小鼠下丘脑4个证候的这些基因一致上调，又以中晚期气阴阳虚证为甚。其中免疫相关基因中晚期明显上调，可能与荷瘤小鼠在长期的下丘脑过度活动后组织的损伤和修复有关，而神经发育及信号传递、蛋白合成及转输相关基因的上调，仍可能提示与神经中枢调节器官下丘脑功能活跃有关。

3.4 荷瘤小鼠下丘脑一致下调的基因

表4显示，荷瘤小鼠下丘脑一致下调的基因较少仅 3个，LOC675606的功能不清楚。小鼠的Hrsp12主要在肝脏和肾脏中表达，在肺和脑部也有表达，它是一种核糖核酸内切酶，可切断单链mRNA中的磷酸二酯键来抑制蛋白的翻译。

Acta2所编码的蛋白是高保守蛋白actins的一员，为构成细胞骨架的成分，在真核细胞中均有这些蛋白的表达。

表4 荷瘤小鼠下丘脑一致下调的基因(芯片读数计算值)

肿瘤发生后，Hrsp12在下丘脑的表达一致下调，这与以上一致上调的基因中含有较多促进基因转录和翻译功能是相一致的，进一步表明荷瘤小鼠下丘脑细胞内基因的转录和翻译活跃。同时结合上调基因中含有较多与炎症功能相关的基因，Acta2的一致下调可进一步说明，荷瘤小鼠下丘脑内细胞的正常架构可能受到了影响。

4 讨论

中医学辨证论治注重同病异证、异病同证。辨证结果显示，荷瘤小鼠存在典型的同病异证现象，那么出现这种现象的物质基础是什么呢?有研究显示，中医的证候尤其是虚证，其与下丘脑-垂体-内分泌轴的功能异常密切相关，下丘脑正是这些功能轴的中枢部分，在调节机体各项功能方面可能发挥举足轻重的作用。本文报道了荷瘤小鼠不同证候下丘脑一致上调或下调的基因，观察肿瘤小鼠下丘脑基因表达变化的共性。

值得注意的是，在本轮实验荷瘤小鼠早期的2个证候中，气虚证的基因表达往往大于邪毒壅盛证，似乎气虚证下丘脑活动更为活跃。为什么会发生这样的改变，其意义如何值得深入研究。

以往限于研究手段，对下丘脑的研究以形态学居多，信息量少，难以充分展现下丘脑病理特征。因而本研究采用先进的 Affymetrix“GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array”，该芯片同步观察16661个核心基因和大量的外显子剪接信息，能较好地反映荷瘤小鼠不同证候下丘脑复杂的基因表达特征。我们分别把同证候的16只小鼠下丘脑样本合并检测，因而其结果反映了小鼠下丘脑不同阶段基因表达量的明显变化。

荷瘤小鼠不同证候下丘脑差异表达的基因可能与肿瘤的发生有关，且有证候特征性，一些基因的一致高表达可能代表了这些证候的本质。

通过文献检索可以看到，学术界以往对这些基因的研究有较多基因与脑部功能有关，虽未直接点到下丘脑，但其应包括在脑部之内。这些基因涉及的功能如神经发育和信息传递等均与下丘脑自身功能密切相关。

[1]方肇勤，侯俐，卢文丽，等.荷瘤小鼠证候的发生、演变、兼证及预后[J].上海中医药杂志，2007，41(1):57-62.

[2]方肇勤，潘志强，卢文丽，等.大鼠、小鼠常见证候计量化辨证方法的建立及其评价[J].中国中医基础医学杂志，2007，13(7):502-505.

[3]方肇勤，潘志强，汤伟昌，等.小鼠四诊工作站构建与操作标准探讨[J].上海中医药大学学报，2006，20(1):42-46.

[4]方肇勤主编.辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证[M].上海科学技术出版社，2006:10.

[5]Vakonakis I，Langenhan TS，et al.Solution structure and sugar-binding mechanism of mouse latrophilin-1 RBL:a 7TM receptor-attached lectin-like domain[J].Structure，2008，16(6):944-53.

[6]梁燕玲，张苏明.突触蛋白的结构与功能[J].医学研究生学报，2003，16(12):929-931.

[7]Chen B，Bixby JL.Neuronal pentraxin with chromo domain(NPCD)is a novel class of protein expressed in multiple neuronal domains[J].Comp Neurol，2005，481(4):391-402.

[8]Duez H，Staels B.The nuclear receptors Rev-erbs and RORs integrate circadian rhythms and metabolism [J].Diab Vasc Dis Res，2008，5(2):82-88.

[9]Lantner F，Starlets D，Gore Y，et al.CD74 induces TAp63 expression leading to B-cell survival[J].Blood，2007，110(13):4303-4311.

[10]Campbell CE，Piper M，Plachez C，The transcription factor Nfix is essential for normal brain development [J].BMC Dev Biol，2008，13(8):52.

[11]Garland P，Quraishe S.Expression of the MAST family of serine/threonine kinases[J].Brain Res，2008，1195:12-19.

[12]Nesbit，M.A.Hodges，M.D.Campbell，L，et al.Genomic organization and chromosomal localization of a member of the MAP kinase phosphatase gene family to human chromosome 11p15.5 and a pseudogene to 10q11.2[J].Genomics，1997，42:284-294.

[13]Zanelli CF，Valentini SR.Is there a role for eIF5A in translation[J].Amino Acids，2007，33(2):351-358.

[14]刘小美，方肇勤，潘志强，等.不同证候H22荷瘤小鼠垂体一致上调或下调的基因[J].上海中医药大学学报，2008，22(4):75-79.