链霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

2010-06-09张桂贤临沂师范学院生命科学学院276005

山东畜牧兽医 2010年3期

张桂贤（临沂师范学院生命科学学院 276005)

链霉素(SM)作为一种重要的氨基糖苷类抗生素，具有性质稳定、抗菌谱广、生产工艺简单、疗效好(尤其是具有强大的抗结核杆菌的作用)，因而被广泛的应用于动物疾病的治疗和预防上。但链霉素具有严重的耳毒性和肾毒性，它在动物性食品中的残留已引起国内外的普遍关注[1-2]。目前，我国对于食品中链霉素残留的检测主要采用仪器分析方法，如气相色谱、液相色谱及质谱法等，这些方法虽灵敏度高，但处理过程复杂，且检测费用高，因此不能广泛应用，而免疫学检测法是未来抗生素残留检测的首选方法，而应用单克隆抗体建立的ELISA法可在生产过程中用于大量样本的快速筛选检测[3-4]。所以本试验研究目的在于制备链霉素的多克隆抗体，为链霉素残留的免疫学检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与器材链霉素(Streptomycin，SM)购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)购自中国医药(集团)上海化学试剂公司(批号F030405)；卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司(批号BP0123)HRP标记羊抗鼠IgG购自北京鼎国生物公司；U-1800型紫外分光光度计由日本日立公司生产；SUNRISE型酶标仪由瑞士TECAN公司生产；96孔可拆式酶标板由浙江省临海市华威分析仪器有限公司生产。

1.1.2 试验动物 SPF级BALB/C纯系小鼠4只，由临沂师范学院实验中心提供。

1.1.3 主要溶液 pH9.6碳酸盐缓冲液: 1.7g Na2CO3，2.8g NaHCO3定容于1000ml 超纯水中，4℃冰箱保存。NaOH试液：取NaOH4.3g，加入双蒸水至100ml。硫酸铁胺试液：取硫酸铁胺0.1g，加入0.5mol/L的硫酸溶液至5ml，使之溶解完全。包被缓冲液(pH 9.6)：准确称取NaCO30.85g，NaHCO31.4g，双蒸水定容至500mL，4℃冰箱保存备用。pH7.4 0.01mol/L的PBS：准确称取KH2PO40.2g、KCL 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、NaCl 8.0g，加双蒸水溶解，定容至1000m，4℃冰箱保存。洗涤液：每100ml pH7.4 PBS中加入50µl的Tween-20，摇匀即可，4℃冰箱保存。封闭液(5%脱脂乳)：称取5g脱脂奶粉溶于100ml pH7.4PBS中，4℃冰箱保存。抗体稀释液：pH7.40.01mol/L的PBS，4℃冰箱保存备用。底物缓冲液：枸橼酸-磷酸缓冲液(枸橼酸0.51g，1.84g Na2HPO4·12H2O定容于100ml纯水中)，4℃冰箱保存。显色液：准确称取OPD(邻苯二胺)5mg，溶于10ml底物缓冲液中，再加入30%H2O 15µl，混匀即可，现配现用。终止液(10%硫酸)：量取浓硫酸10ml，逐滴加入到90ml双蒸水中，混匀，室温保存备用。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的制备制备方法采用直接化学交联法，链霉素可以利用分子中的醛基和蛋白质的氨基直接缩合，反应路线见图1[5]：

图1 SM与载体蛋白合成路线

具体合成路线:（1）称取BSA 50mg，溶解于6ml的pH为9.6的碳酸盐缓冲液中。（2）称取链霉素 82.5mg 溶解于4ml的pH为9.6的碳酸盐缓冲液中。（3）将上述两种溶液混合，并于37℃ 轻微搅拌反应12h。（4）将反应液收集用pH7.20.01mol/L的磷酸缓冲液透析48h。并收集12h、24h、48h的透析液。（5）将透析后的反应物小量分装-20℃冻存备用。

将卵清蛋白与链霉素的偶联也采用同样方法，将偶联物作为包被原，用于间接ELISA法。

1.2.2 人工抗原的鉴定 (1)显色反应。链霉素在碱性溶液中，分子发生重排，使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺和链霉胍，生成麦芽酚(α-甲基-β-羧基-γ-吡喃酮)，麦芽酚与硫酸铁铵溶液形成紫红色配位化合物[6]。根据链霉素所特有的性质可以通过麦芽酚反应进行鉴别试验，通过对透析后产物进行麦芽酚反应初步鉴定链霉素是否联结成功，同样对透析外液进此反应可以初步鉴定反应物是否透析完全。透析产物最终通过紫外分光光度计来进一步确定是否连接成功，并估算人工抗原的浓度，为下一步实验奠定基础。具体作法：将不同时段收集的透析液分别取1ml，然后加入0.3mL NaOH试液。37℃水浴3min后，加入0.5ml硫酸铁胺试液显色，如果有紫红色，则说明含有链霉素，如果没有则透析干净了。确定透析外液不含链霉素后，则取透析后的反应物1ml，然后加入0.3ml NaOH试液。37℃水浴3min后，冷却至室温后，加入0.5ml硫酸铁胺试液显色，如果有紫红色，则说明含有链霉素，联结成功。（2）紫外扫描。用PBS配制好标准溶液(SM、BSA和OVA)及人工抗原(SMBSA和SM-OVA)溶液，通过紫外分光光度计扫描，比较透析产物的特征峰是否是链霉素和蛋白载体特征峰的叠加，且出现了偏移。透析产物通过紫外分光光度计来初步确定是否交联成功，参考杨利国[7]，OD280/OD260＜1.5时，蛋白质含量(mg/ml)=(1.45×OD280- 0.74×OD260)×稀释倍数，粗略估算结合蛋白的浓度，以确定小鼠的免疫剂量。

1.2.3 动物免疫将小鼠编号，并做好标记，取一定量制备成功的免疫原(SM-BSA)与等体积的弗氏完全佐剂乳化，依据估算浓度保证每只BALB/C小鼠的剂量100µg/只，0.2ml/只[8]，腹腔注射。第14、35d将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂同法进行加强免役，自二免后的每免7～10d断尾采血，2000rpm离心5min分离得到多抗血清。

1.2.4 多抗血清的检测对标记小鼠，断尾采血，将包被原1:40稀释，抗血清1:100稀释，二抗采用1:1000稀释，按照表1间接ELISA流程表[9]测定抗血清效价，用P表示测定值，N表示阴性对照值，结果以P/N﹥2.1且P-N﹥0.2为临界判定值。

表1 间接ELISA的流程表

1.2.5 多抗血清的特异性分析参考文献[10]将链霉素用0.01mol/l pH7.4的PBS稀释成一系列浓度(10000、1000、100、10、1、0.1ng/ml)，分别取100µl与浓度为1:100的多抗100µl在离心管中混匀，置37℃温箱中孵育30min。分别取100µl加入预先用最适抗原包被浓度包被好的酶标板中，同种浓度的SM作2个重复，其他操作同上表1。B/B0%=OD490实验组/OD490对照组×100%，以链霉素浓度的对数值为横坐标，B/B0%为纵坐标作标准曲线，求出回归方程和IC50(B/B0%=50%)值。抗体特异性试验：将链霉素、庆大霉素、卡那霉素、双氢链霉素、硫酸新霉素配制成系列药物浓度，作竞争抑制实验，求出各自的IC50，根据交叉反应率= IC50链霉素/ IC50试验组药物×100%，求出各自的交叉反应率。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定

2.1.1 显色反应链霉素麦芽酚显色反应结果表明：12h后的透析外液有颜色反应，24h后的没有颜色反应，则表明透析外液基本不含链霉素，透析基本完全。收集48h后透析产物，经过麦芽酚反应显色(紫红色)明显，这说明透析产物存在且联结在蛋白质上，初步确定链霉素与蛋白质联结成功。

2.1.2 UV鉴定

图2 载体蛋白质和偶联物紫外扫描图

BSA、OVA、SM、SM-BSA和SM-OVA五个样品经紫外分光光度计扫描，结果(见图2)显示SM无明显紫外吸收峰与资料[11]吻合，BSA和OVA分别在278.5nm和279nm波长处有最大吸收峰，SM-BSA和SM-OVA的最大吸收峰分别在278nm和279.5nm波长处。根据UV吸收的合加性原理可知，整合后的特征峰与半抗原和载体没有重合，出现了偏移，说明半抗原SM已分别与载体BSA和OVA交联成功。

扫描SM-BSA，OD(280)值为0.64，OD(260)值为0.44，估算SM-BSA结合蛋白含量为1.65mg/ml；扫描SM-OVA，OD(280)值为0.54，OD(260)为0.33，估算SMOVA结合蛋白含量为0.54mg/ml。

2.2 多抗血清效价测定与特异性分析

对三免后的标记小鼠断尾采血，间接ELISA测定OD值，3只小鼠均出现了阳性结果见表2，效价1:51200。

表2 多抗血清OD值

2.3 多抗血清特异性分析

图3 链霉素间接竞争ELISA标准曲线

间接竞争ELISA阻断试验结果见图3，链霉素浓度在1ng/ml～100ng/ml范围内，小鼠多抗抑制曲线呈良好的线性关系，其中鼠3抑制性最好，其抑制曲线回归方程为y=-19.96x+77.42 R2=0.9695，鼠3的IC50为23.62ng/ml，低于鼠2和鼠3。交叉试验结果(见表3)表明链霉素多抗与双氢链霉素交叉达107%，而与同类的其他药物无交叉反应。

表3 间接竞争ELISA的交叉反应实验结果

3 讨论

3.1 人工抗原的合成

链霉素属于不含伯胺基的氨基糖苷类抗生素，可采用两种方法制备免疫原。（1）利用醛基可以采用O-(羧甲基)羟基胺法，将其生成含有带羧基的半抗原衍生物，然后采用碳化二亚胺法，将带有羧基的半抗原与载体蛋白的胺基或者羧基结合[11]。（2）利用链霉素其醛基直接与载体蛋白的胺基缩和[5]。本试验采用了方法（2）。此法试验条件容易控制，且所需试剂常用价廉，抗原的合成易于实现。