复合诱变选育柚苷酶高产菌株的研究

李志坚，谭兴和，单 杨，李高阳

（1.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙 410125；2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128）

柚皮苷（Naringin）是普遍存在于柑桔类水果中的一种双氢黄酮类化合物，学名为柚配质7-D-葡萄糖（2→1）-α-L 鼠李糖苷[1]，是柑桔鲜果及其制品中的主要苦味物质。柑桔汁中含有一定苦味是保持产品特有风味必不可少的[2]，但过量存在使产品出现过度苦味令消费者难以接受，同时也影响和制约了柑桔加工业的发展。脱苦方法有很多种，如：酶法、吸附法、添加苦味抑制剂法[3]、超临界CO2脱苦法、屏蔽脱苦法[2]等。酶法脱苦主要是利用柚苷酶在一定条件下分解柚皮苷成为无苦味物质而达到脱苦的目的，具有其他方法所没有的高效、快速及高选择性、操作简单、脱苦条件温和、脱苦效率高和没有副作用等优点，因而具有良好的研究与应用前景[4]。柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的一种复合酶[5]，最初由Hall[6]从芹菜种子中分离得到的，后来Ting S V[7]曾在一些利用真菌生产的果胶酶制剂中发现并分离到这种酶。目前国内外柚苷酶主要采用微生物发酵法进行生产。但从自然界中筛选的产酶菌株其产酶能力一般都较弱，已有报道用紫外线照射[8]和化学诱变[9-10]方法可得到更高产酶能力的菌株。如陈玲等[11]用亚硝基胍（NTG）对柚苷酶生产菌出发菌株孢子进行诱变处理，得到的菌株比出发菌株的产酶能力提高了近1倍。本文以自然界筛选的黑曲霉FY01-4为出发菌株，采用紫外线和60钴自然衰变产生的γ射线作为诱变因子，对出发菌株进行复合诱变处理，旨在筛选得到新的高产柚苷酶突变菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 黑曲霉FY01-4，酶活为357.9 U/mL，由湖南省农产品加工研究所微生物实验室自行筛选保藏。

1.1.2 仪器 V-1 700型紫外-可见分光光度计、QHZ-98 A全温度振荡培养箱、紫外诱变箱（15 W紫外线灯）、磁力搅拌器、GNP-9160型隔水式恒温培养箱、60 Co-γ射线辐射源、超净工作台等。

1.1.3 培养基 蔡氏培养基（Czapek’琼脂）:蔗糖30.0 g/L，NaNO33.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO41.0 g/L，琼脂15.0 g/L，pH 6.0～6.5，0.1 MPa蒸汽灭菌 20 min。柚苷低糖培养基：MgSO4·7H2O 5 g/L，K2HPO410.0 g/L，KCl 5.0 g/L，FeSO40.1 g/L，琼脂 12.0 g/L，蔗糖10.0 g/L，柚苷 2.5 g/L，自然 pH 值（6.0～6.5），0.1 MPa蒸汽灭菌20 min。摇瓶发酵培养基：豆渣（含水40%～50%）10%，豆粕4%，葡萄糖2%，柚苷0.02%，自然 pH 值，250 mL三角瓶装 30～50 mL，0.1 MPa蒸汽灭菌30 min。

1.1.4 诱变剂 以紫外线、60Co-γ射线作诱变剂。

1.2 方法

1.2.1 诱变选育 诱变选育程序如下：出发菌株→紫外诱变→平板分离→摇瓶筛选→60 Co-γ射线诱变→平板分离→摇瓶筛选→稳定性试验[12]。

单孢子悬浮液的制备：出发菌株斜面30℃培养4～5 d，用无菌生理盐水洗下孢子，转入盛有100 mL生理盐水带玻璃珠三角瓶中，在震荡器上震荡1 h，充分打散孢子，经无菌漏斗（内有脱脂棉）过滤除去菌丝，取样计数并用无菌生理盐水调整孢子浓度至l06个/mL，制成单孢子悬浮液。

紫外诱变：将孢子悬液装入带有磁力搅拌子的无菌培养皿（直径9 cm）内，置于磁力搅拌器上，距离15 W紫外灯25 cm进行紫外照射，照射时间分别为 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270 s，然后取不同照射剂量的处理液适当稀释涂布平板，于恒温30℃避光培养4 d。培养后对活菌进行计数，计算致死率并绘制致死曲线。从致死曲线中找出致死率为80%左右的诱变剂量，并以该剂量正式处理孢子悬液，然后涂布平皿，挑取单菌落进行摇瓶筛选，测定其发酵液酶活。

60Co-γ射线诱变：经紫外诱变筛选后，将所得菌落制备成孢子悬液，分别吸取10 mL孢子悬液装入27支无菌试管，每3个为1组，共分为9组，于30℃恒温振荡培养 1 h。分别以 0、150、300、450、600、750、900、1 050、1 200 Gy 剂量的 γ 射线处理。将处理液稀释涂布平板，于30℃避光培养4 d，进行活菌计数，计算致死率，并绘制致死曲线。从致死曲线中找出致死率为80%左右的诱变剂量，并以该剂量正式处理孢子悬液，然后涂布平皿，挑取单菌落进行摇瓶筛选，过滤后测定发酵液酶活。

菌株的摇瓶筛选：诱变后的孢子悬液涂布平板后，分离得到的单菌落经斜面培养成熟后用无菌水洗涤孢子，制成终浓度为106个/mL的孢子悬液，按10%的接种量接种于装有30 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，30℃回旋式摇床180 r/min培养5 d，发酵后过滤，测定发酵液酶活。

遗传稳定性试验：将复筛得到的产酶活力较高的菌株连续传代10代，分别测定菌株产柚苷酶活力。孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数，诱变致死率采用平板活菌计数来测定。

1.2.2 柚苷酶活力的测定 取摇瓶培养物，以3 000 r/min离心20 min，所得的上清液即为粗酶液。取2 mL 0.1%柚苷标准溶液和0.2 mol/L、pH 4.0醋酸缓冲液1.9 mL置于试管中，在40℃恒温水浴中预热4～5 min，然后加入预先稀释好的酶液0.1 mL，充分摇匀，准确保温30 min，迅速吸取0.1 mL，置于15 mL的比色管中，加入90%一缩二乙二醇（DEG）5 mL，蒸馏水0.4 mL和1 mol/L NaOH溶液0.5 mL，摇匀，在30℃保温 30 min，倒入厚度为 1 cm的比色皿中，在420 nm波长下测定光密度。柚苷酶活力的定义为：在40℃，pH 4.0条件下每分钟每毫升酶液分解柚皮苷的微克数[1]。

1.2.3 数据处理与分析 致死率（%）=（未经诱变菌液菌落总数－诱变后菌液菌落总数）/未经诱变菌液菌落总数×100

正变率（%）=诱变后酶活力增加的菌株总数/诱变后菌株总数×100

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变剂量的选择

以紫外照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死曲线（见图1）。从图l可以看出，当照射时间为210 s时，出发菌株几乎全部致死，而当照射时间为180 s时，致死率在80%左右。由于致死率在80%左右时正突变的机率较高，故选择180 S作为紫外诱变剂量。

图1 紫外线致死曲线及突变率

2.2 紫外诱变筛选

以180 s作为紫外诱变剂量对出发菌株孢子悬液进行诱变，共挑取出60个突变株，经过摇瓶筛选，其中27个突变株的柚苷酶活较出发菌株有明显提高。最高8株的酶活如图2所示。突变株UV13的产酶酶活最高，为848.5 U/mL，是出发株的2.37倍，故选择突变株UV13作为下一步诱变的菌株。

图2 紫外诱变结果

2.3 60Co-γ射线辐照剂量与致死率的关系

通过观察60Co-γ射线的诱变剂量与菌体致死率之间的关系，按照诱变剂量选择的一般原则，选取菌体致死率大约在60%～95%之间的诱变剂量来观察其正突变率。如图3所示，不同剂量的γ射线对诱变菌株均有致死作用，且致死率随辐照剂量的增加而提高，当剂量为750 Gy时，细胞致死率达80%，此时正变率较高，而剂量达到900 Gy时，致死率接近100%，根据筛选微生物菌种的要求及以上结果，确定750 Gy为合适辐照剂量。

图3 照射剂量与致死率、突变率曲线

2.4 60Co-γ射线诱变筛选

以750 Gy作为60Co-γ射线诱变剂量照射突变株UV13制成的孢子悬液，经柚苷低糖培养基培养共筛选出35个突变株，经摇瓶复筛，其中20个突变株的发酵酶活较出发菌株高，以其中酶活最高的8株和紫外诱变筛选出的UV13的发酵酶活绘图（见图4）。从图4可看出，突变株C15的发酵酶活最高，为1 285.6 U/mL，是出发株的3.59倍、紫外诱变株UV13的1.52倍。

图4 60Co-γ射线诱变结果

2.5 突变株C15遗传稳定性试验

由于经诱变所得到的菌株产酶性状常常不稳定，尤其在连续传代培养时。为了考察诱变菌株C15产酶能力的稳定性，我们将其在斜面上连续移接10代，进行摇瓶发酵，如图5所示，其子代的酶活基本保持在1 200～1 300 U/mL之间，产酶能力稳定。

图5 稳定性试验结果

3 结论与讨论

紫外线辐射能引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等从而导致基因突变，常被应用于诱变育种上。60Co-γ射线作为一种电离射线，它可引发生物基因突变和染色体畸变[13]。因此，通过紫外线和60Co-γ射线对菌株进行复合诱变处理可能会产生有利于生产的突变从而选育到优良菌株。研究表明，经过紫外诱变所得突变株UV13的发酵酶活是出发株的2.37倍。在紫外诱变的基础上，利用60Co-γ射线进行复合诱变，可进一步提高酶活，最终突变株C15摇瓶发酵酶活达1 285.6 U/mL，分别是出发株和紫外诱变株的3.59倍和1.52倍，酶活明显提高。经传代试验，该突变株具有稳定的遗传性状。但作为生产用菌株，还需进一步优化其发酵产酶条件及发酵工艺，深入研究各种环境因素对菌株产酶的影响。另外，传统诱变方法无法产生定向突变，难以找到与性状改变相对应的基因改变，不能从根本上掌握微生物的代谢调控机理，且筛选的工作量大、育种周期长，故可以考虑将传统诱变方法与分子生物学方法相结合对菌株进行改造，进一步提高育种效率[14]，筛选到产酶性状更加优良的菌株。

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