菊苣种质资源遗传多样性的SRAP研究

罗燕，白史且，彭燕，张玉，马啸

（1.四川省草原科学研究院 四川 成都611731；2.四川农业大学草业科学系 四川 雅安625014）

菊苣（Cichoriumintybus）为多年生草本植物，是一种高产优质的饲用牧草，原产于地中海、中亚和北非。菊苣在大洋洲的新西兰、澳大利亚和欧洲法国、意大利以及北美洲的美国等地亦为重要的牧草资源［1］。可将菊苣和粮食作物进行间种，可解决牧草种植与粮食作物争地问题，促进种植业结构向多元化发展［2］。在我国，菊苣主要分布于北京（百花山）、黑龙江（饶河）、辽宁（大连）、山西、陕西、新疆（乌鲁木齐、伊宁、阿勒泰）等地，生于滨海荒地、河边、水沟边或山坡。

目前，我国已经登记了2个菊苣品种，皆为引进品种。从总体而言，菊苣资源的研究相对于其他牧草和作物也还有一定的差距，一些珍贵的优良生态型以及居群分布正在缩小，菊苣基因资源还在丢失，资源研究的深度和资源收集的广度不够，可以供筛选的优秀种质缺乏，严重影响了菊苣品种的选育。当前，围绕菊苣遗传多样性的研究已经有相关报道，Van Cutsem等［3］采用AFLP标记对菊苣野生种和栽培种之间的基因流动进行了研究；Baes和 Van Cutsem［4，5］用同工酶，Kiers等［6］及 Koch和Jung［7］用 RAPD和 AFLP标记证明菊苣栽培种中存在丰富的遗传多样性；Baes和Van Cutsem［5］研究了栽培野生种、商业品种和布鲁塞尔菊苣3个基因库的10种同工酶的多态性。目前，对菊苣种质资源进行SRAP分子标记的研究尚未见报道。

DNA是生物的遗传物质，DNA的多态性是生物多样性的本质内容。目前，国内外许多学者都已经利用DNA分子标记技术在草坪草及牧草上进行了各种研究［8－10］。相关序列扩增多态性（sequence－related amplified polymorphism，简称SRAP）［11］，是由 Li和 Quiros［12］在2001年创建的一种 DNA 分子标记技术，具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点［13］，它克服了 RAPD（random amplified polymorphic DNA）重复性差、SSR（simple sequence repeats）位点较少、AFLP（amplified fragment length polymorphism）成本高的缺点，其重复性和稳定性好，已被应用于图谱构建、比较基因组学和遗传多样性分析，是当前检测种质资源遗传多样性、构建高密度连锁图谱、定位克隆基因、品种鉴定等的有力工具。SRAP在草业科学领域中的研究不多，Budak等［13］利用34对SRAP引物组合分析了53份野牛草（Buchloëdactyloides）基因型之间的遗传多样性及表型关系。陈宣等［14］对结缕草属（Zoysia）植物耐盐性SRAP分子标记进行了研究。季杨等［15］对多花黑麦草品种（系）（Loliummultiflorum）间杂交及其杂种后代进行SRAP遗传分析。薛丹丹等［16］对通过SRAP分子标记技术对结缕草属植物种间杂交的5个组合37份杂交后代进行了真假杂种的鉴定。

本研究采用SRAP分子标记技术对48份菊苣材料的基因组DNA进行了多态性扩增，旨在从分子水平对不同类群菊苣资源进行遗传多样性分析，为综合评价菊苣种质资源，筛选菊苣优良种质和新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菊苣种质材料从国内外收集而来，总计48份。其中13份来自意大利，10份来自荷兰，10份来自法国，3份来自匈牙利，2份来自德国，2份来自波兰，2份来自瑞士，1份来自葡萄牙，5份来自四川省草原科学研究院（表1）。

表1 供试菊苣的资源编号及来源Table 1 Accesion code and sources of C.intybus used in this study

1.2 基因组DNA提取

2008年3月随机选取不同材料的菊苣健康幼叶，采用Plant Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）进行DNA提取。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，合格的DNA样品于－20℃冰箱内保存备用。

1.3 SRAP－PCR反应

参照Li等发表的引物［9］，设计了8条上游引物和11条下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表2）。SRAP－PCR反应采用的是复性变温法：循环包括94℃变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，共5个循环；之后35个循环：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min；4℃保存。

扩增反应总体系为20μL：模板DNA 4μL（60 ng／μL），10×PCR Buffer 2μL，Mg2＋2μL（25 mmol／L），d NTP 1.6μL（2.5 mmol／L），Tag酶0.4μL（2.5 U／μL），上、下游引物均为0.2μL（10μmol／μL），灭菌水5.2 μL，矿物油覆盖。

表2 用于菊苣SRAP分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analyses of C.intybus

1.4 扩增产物的分离和检测

DNA扩增产物在0.5×TBE缓冲系统中，用含有溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖电泳分离，同时以DL 2000 Markers（北京天根生化科技有限公司）作为分子量标记。恒压120 V，时间150 min，使用BIO－RAD自动凝胶成像系统观察并照相。

1.5 数据统计及分析

对扩增产物按条带有无分别赋值，有带记为1，无带记为0，构成遗传相似矩阵。据表征矩阵，统计SRAP扩增产物的条带总数和多态性条带数量，计算多态性位点率（P）和引物多态性信息含量（PIC）［17］，PICi＝2fi（1－fi），其中，PICi表示引物“i”的多态性信息含量，“fi”表示有带所占的频率，“1－fi”表示无带所占的频率。利用NTSYS－PC 2.10软件计算Dice遗传相似性系数（GS），根据UPGMA法［18］进行聚类分系以及采用EIGEN方法进行主成分分析（PCo A）。

2 结果与分析

2.1 供试材料SRAP扩增产物的多态性分析

通过8条上游引物和11条下游引物的筛选（表3），选定28对（组）可产生多态性且重复性好的引物对5个地理类群48个个体的基因组DNA进行SRAP扩增，共得到333条清晰可辨条带。其中，多态性条带318条，多态性位点 （P）平均为95.09%。平均每对引物扩增出11.89条带，其中11.36条具有多态性，多态位点最多的为17个，最少的为9个；多态信息含量（PIC）范围为0.23（me3＋em3）到0.44（me1＋em10），平均为0.33；表明供试菊苣材料种质间SRAP变异大，多态性高，存在丰富的遗传多样性（表3）。

表3 28对SRAP引物组合的扩增结果Table 3 SRAP results from 28 primer combinations

2.2 供试材料的遗传多样性分析

2.2.1 供试菊苣种质间亲缘关系分析 对扩增结果采用Nei－Li相似系数（GS）计算方法，得到供试材料遗传相似性矩阵，以此为依据分析材料间亲缘关系。48份材料间的GS值范围为0.55～0.89，平均GS值为0.69。其中PI652004（15号）和PI652005（16号），PI651985（17号）和 PI651986（18号）遗传相似系数最大，为0.89，表明其亲缘关系最近；材料PI651986（18号）和B－2－7（46号）的遗传相似系数最小，为0.55，表明二者的亲缘关系最远。从遗传相似性分析可知，菊苣具有非常丰富的遗传多样性（表4）。

2.2.2 供试材料各地理类群的遗传多样性指数地理类群间的遗传相似系数分析表明，5个地理类群的GS值为0.63～0.96，法国类群和意大利类群的遗传相似性系数最大为0.96，它们间的亲缘关系最近。中国类群和法国类群的遗传相似系数最小为0.63，表明两类群的亲缘关系最远。这可能是由于法国和意大利同属欧洲，相同或相似的生态地理环境加上自然突变、人为选择及基因漂移的存在使得法国类群和意大利类群的菊苣在形态特征、生态类型和基因等方面保持了一定的趋同性，体现出较近的亲缘关系。而中国类群和法国类群的菊苣位于不同的洲，地理隔离可能阻碍了相互间的基因交流，种质间的某些独特的基因得以保留，使材料间体现出较大的遗传变异。从多态性位点率（P）和香农指数（Shannon index）2个遗传多样性参数来看，5个类群遗传多样性水平从高到低的顺序为：荷兰＞意大利＞欧洲其他地区＞法国＞中国（表5）。

2.3 供试材料基于Nei－Li（Dice）遗传相似性的聚类分析

基于遗传相似系数，利用UPGMA法对供试材料进行聚类分析（图1）。在遗传相似系数为0.68处上把48份菊苣材料聚为5类，来自相同地区的材料能基本聚为同一类。

来自法国的10份材料聚为Ⅰ类。1号（PI 651933）和4号（PI 651936）之间的遗传距离较远，可能是因为1号（PI 651933）来自法国曼恩卢瓦尔省（Maine－et－Loire），属于卢瓦尔河地区，该地区气候温和；而4号（PI 651936）来自法国埃松省（Essonne），该省是法国最干燥的省份之一，降水量较低。这种不同的地理位置和多样的气候变化，导致材料之间产生多样性。

表4 供试材料间遗传相似性系数Table 4 The genetic similarity index of accessions tested

续表4 Continued

来自意大利的13份材料聚为Ⅱ类。意大利属于地中海沿岸国家，此地区属于典型的地中海型气候类型，夏季炎热干燥，冬季温和多雨，且该区多为山脉和高原，海岸线曲折，而这样的气候以及地理位置容易产生多样的小生境。

来自荷兰的10份材料聚为Ⅲ类。其中，15号（PI 652004）和16号（PI 652005），17号（PI 651985）和18号（PI 651986）之间的遗传距离最近，可能是因为15号（PI 652004）和16号（PI 652005）来自同一个地方（South Holland），而 17 号（PI 651985）和 18 号（PI 651986）也来自同一个地区（Limburg），类似的生境和气候导致了材料之间的一致性，由此可以看出，来自相同或者相似地理和气候类型的材料能聚在一起，这为积累提供了合理性。来自欧洲其他地区的材料聚为Ⅳ类。

来自中国的材料聚为Ⅴ类。其中，45号 （B－1－1）和46号 （B－2－7）能最先聚在一起，这2份材料田间表现为叶片呈墨绿色，叶缘无锯齿，且为根部分蘖。

从聚类结果可以看出，相同或相似地理来源和气候类型的材料能基本聚在一起，说明遗传多样性与地理来源和气候类型有一定的关系。

表5 菊苣不同地理类群遗传多样性指数Table 5 Different geographic group heredity multiple indices of C.intybus

图1 菊苣的Nei－Li遗传距离的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li genetic distance

2.4 菊苣主成分分析

对48份供试菊苣材料的SRAP标记的原始矩阵进行主成分分析，前3个主成分所能解释的遗传变异分别为17.27%，7.64%，5.47%，对48份菊苣种质做前3个主成分的三维排序图（图2），位置靠近者表示关系密切，远离者表示关系疏远，将位置靠近的菊苣材料划归为一类，可将供试材料分成五大类，结果表明主成分分析结果与聚类结果基本一致，同一地区的大部分材料基本能聚在一起，主成分分析结果更直观地表明了不同菊苣材料的亲缘关系。

3 讨论

3.1 SRAP标记对菊苣遗传多样性研究的有效性

本研究利用SRAP标记技术分析了48份菊苣种质的遗传多样性关系。28对引物在48份菊苣基因组DNA中检测到333个位点，多态性条带比例为95.09%，材料间遗传相似系数范围为0.55～0.89，从而在分子水平上证明了不同菊苣之间差异较大，遗传多样性丰富。本实验中，菊苣SRAP标记表现出较高的多态性（95.09%），由此可见，SRAP技术可以作为研究菊苣遗传多样性简单、有效的方法。

3.2 菊苣种质遗传变异与地理来源的相关性分析

遗传变异和地理环境之间的关系一直是植物种群遗传学研究中普遍关注的问题，多数研究认为种质的地理分布与分子标记间存在相关性［19］。在本次研究中这种相关性也得到了证明，研究利用28对引物对48份菊苣种质资源进行了SRAP统计分析和聚类分析，发现菊苣材料之间存在着比较高的遗传分化。

图2 基于SRAP谱型的菊苣材料主成分分析Fig.2 Principal component analysis based on SRAP patterns in C.intybus

聚类分析及主成分分析表明，供试菊苣材料呈现出较好的地域分布规律，这可能是由于菊苣材料在进化过程中受到自然选择淘汰，自然选择的结果使得个体中所发生的不定向变异造成群体遗传结构的定向变异，这样经过长时间的进化演变，同一地区大部分材料的基因型可能趋于相似，比如来自法国和意大利的材料可以单独聚为一类。但是聚类也并非完全符合地域性的分布规律，比如来自葡萄牙（PI 652050，30号）和匈牙利（PI 652020）的材料能聚在一起，而来自波兰的2份材料（PI 652007，23号和PI 652051，24号）没能聚在一起，造成上述这种聚类划分的现象可能有以下3个方面的原因：1）基因突变，物种在进化过程中，有个别的基因发生了变异，若该突变体能较好地适应当地的环境，这个变异基因就能得到保存；2）本研究材料来源于海拔、气候特征和土壤类型等方面存在较大差异的地区，多样的生境可能阻碍了种质间的基因漂移从而造成较大的遗传差异，但在大的地理条件下如果存在相同或相似的生境条件，相同或相似的选择压力和生存环境导致远距离间也可能会产生遗传变异；3）是自然因素和人类活动造成的，风力输送、江河冲刷、鸟类和人类交通工具的携带等都可能使其转入异地扩展繁殖。

［1］焦春海.美国转基因作物生产动态［J］.世界农业，2005，11：49－51.

［2］王孝华，阮培均，梅艳，等.玉米与菊苣不同密度间作实验［J］.草业科学，2009，26（8）：137－140.

［3］Van Cutsem P，du Jardin P，Boutte C.，etal.Distinction between cultivated and wild chicory gene pools using AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：713－718.

［4］Baes P G，Van Cutsem P J.Chicory seed－lot variety identification by leucine－aminopeptidase and esterase zymogram analysis［J］.Electr－ophoresis，1992，13：885－886.

［5］Baes P G，Van Cutsem P J.Isozyme polymorphism in three gene pools of cultivated chicory （CichoriumintybusL.）［J］.Euphytica，1993，71：143－150.

［6］Kiers A M，Mes T，van der Meijden R，etal.A search for diagnostic AFLP markers inCichoriumspecies with emphasis on endive and chicory cultivar groups［J］.Genome，2000，43：470－476.

［7］Koch G，Jung C.Phylogenic relationship of industrial chicory varieties revealed by RAPDs and AFLPs［J］.Agronomy，1997，17：323－333

［8］王晓丽，凡星，张春，等.用nrDAN ITS序列探讨小麦族含St H基因组物种的系统发育［J］.草业学报，2009，18（6）：82－90.

［9］范彦，李芳，张新全，等.扁穗牛鞭草种质遗传多样性的ISSR分析［J］.草业学报，2007，16（4）：76－81.

［10］刘伟，张新全，李芳，等.西南地区野生狗牙根遗传多样性的ISSR标记与地理来源分析［J］.草业学报，2007，16（3）：55－61.

［11］Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of some accessions ofCucurbitamaximafrom Spain using RAPD and SBAP markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50：227－238.

［12］Li G，Quiros C F.Sequence－related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455－461.

［13］Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，etal.Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence－related amplified polymorphism markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108：328－334.

［14］陈宣，郭海林，薛丹丹，等.结缕草属植物耐盐性SRAP分子标记研究［J］.草业学报，2009，18（2）：66－75.

［15］季杨，张新全，马啸，等.多花黑麦草品种（系）间杂交及其杂种后代SRAP遗传分析［J］.草业学报，2009，18（4）：260－265.

［16］薛丹丹，郭海林，郑轶琦，等.结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定－SRAP分子标记［J］.草业学报，2009，18（1）：72－79.

［17］Roldan－Ruiz I，Dendauw J，Van Bockstaele E，etal.AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses（Loliumspp.）［J］.Molecular Breeding，2000，6：125－134.

［18］Rohlf F J.NTSYS－pc：Numerial Taxonomy and Multivariate Analysis System（Version 2.0）［M］.New York：Exter Software，1994.

［19］Wilson B L，Kitzmiller J，Rolle W，etal.Isozyme variation and its environmental correlates inElymusglaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139－153.