阿托伐他汀对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的干预作用

唐霍全,仝海波,光俊荣,范益民,刘跃亭,郝解贺

脑血管痉挛(CVS)是蛛网膜下腔出血(SAH)常见的并发症之一,发病率高达30%～90%,是导致患者伤残率和病死率居高不下的主要原因之一[1]。近年的研究发现,痉挛血管壁组织的凋亡在血管痉挛形成的机制中有重要的作用[2,3],阿托伐他汀具有保护神经和改善蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的作用[4]。本实验通过观察大鼠SAH后早期应用阿托伐他汀对基底动脉的影响,探讨其对SAH后CVS的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性SD大鼠30只,体重250 g～300 g,购自山西医科大学实验动物中心。随机分为假手术组(A组)、SAH 组(B组)、阿托代他汀组(C组)。

1.2 药品与试剂 阿托伐他汀(辽宁辉瑞制药有限公司,每片20 mg),T UNEL试剂盒(北京中杉金桥公司),DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.3 动物模型制作与标本处理[5]动物模型制作:采用枕大池二次注血法制作大鼠SAH-CVS动物模型。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后,大鼠头部及左侧股动脉区备皮,常规消毒;大鼠仰卧位,暴露左侧股动脉备用;然后改俯卧位,取枕外隆凸以下约2.0 cm正中直切口,暴露枕骨、环椎及环枕膜,用1 mL注射器针头刺破环枕膜并稍稍推进到达枕大池;有脑脊液流出后,用1 mL注射器抽取股动脉血0.3 mL,在2 min之内注入枕大池;注血后环枕膜穿刺处填塞明胶海绵一块,俯卧位头低30°约30 min,以利血液沉积在脑底血管周围,缝合头部及股部切口。48 h后同法抽取右侧股动脉血0.3 mL注入枕大池,制成大鼠SAH动物模型。假手术组仅在枕大池内注射生理盐水(0.3 mL),其余步骤相同。

灌胃:首次注射后1 h开始灌胃,每日1次,连续给7 d。阿托伐他汀组:给予阿托伐他汀20 mg/(kg◦d)灌胃[4](溶于2 mL蒸馏水)1次给予。假手术组与SAH组灌喂同阿托伐他汀组相同体积的蒸馏水2 mL,1次给予。标本处理:所有大鼠均于第一次手术后7 d处死。处死前均给予10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰卧位固定,开胸,用 12号针头左心室穿刺快速灌入37℃生理盐水300 mL,待心脏鼓起后在右心房迅速剪开一小口,放出血液,生理盐水在5min内灌完,再灌入4℃4%的多聚甲醛至少30 min等组织变硬后取出带完整基底动脉的脑干,然后置于上述灌注液中继续固定24 h,常规石蜡包埋,切片(4 μ m)。

1.4 管壁厚度和内径周长的测量 脑干横断面石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察各组大鼠BA微观结构的变化,用Image Pro Plus v5.0图像分析软件测量BA血管内径周长和血管壁厚度。

1.5 原位末端标记法(TUNEL)检测 石蜡组织切片常规脱蜡至水,依次滴加蛋白酶K,TUNEL反应混合液,T UNEL过氧化物酶标抗体(POD),DAB溶液显色至水,苏木精复染,脱水,透明,中性树胶封片。同时做不加TdT酶,其他条件相同的阴性对照。每张切片于250倍光学显微镜下观察3个无重复视野,每只动物观察3张切片。计算呈棕色的Tunel阳性细胞核和所有细胞核,细胞凋亡率=(阳性细胞核数/所有细胞核数)×100%[6]。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下观察BA微观结构的变化 假手术组BA血管内皮细胞完整平覆于内弹力纤维环上,平滑肌细胞排列有序呈长梭形环绕血管腔,平滑肌层薄。SAH组可见内皮细胞随内弹力纤维向血管腔隆起,平滑肌细胞排列杂乱,平滑肌层较厚。阿托代他汀组则介于二者之间。

2.2 显微镜观察并计算BA内径周长和管壁厚度(见表1)SAH组与阿托伐他汀组的内径周长较假手术组均减少(P＜0.01),管壁厚度却较假手术组均增加(P＜0.05或P＜0.01);而SAH组内径周长减少和管壁厚度增加较阿托伐他汀组更显著(P＜0.05)。

表1 SD大鼠BA血管壁内径周长、厚度及细胞凋亡率(±s)

表1 SD大鼠BA血管壁内径周长、厚度及细胞凋亡率(±s)

组别 n 内径周长 管壁厚度(μ m)细胞凋亡率(%)假手术组 10 885.71±21.68 11.21±0.98 12.64±1.91 SAH 组 10 594.94±18.382) 16.91±0.562) 6.55±1.212)阿托伐他汀组 10 721.95±24.192)3) 12.09±0.591)3) 3.44±0.742)3)与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与SAH组比较,3)P＜0.05

2.3 T UNEL法检测细胞凋亡率(见表1)假手术组BA平滑肌细胞凋亡率较低,SAH组与阿托伐他汀组平滑肌细胞凋亡率较假手术组均增多(P＜0.01),而阿托伐他汀组细胞凋亡率较SAH组更显著(P＜0.01)。

3 讨 论

SAH后CVS的高发生率是多因素共同作用的结果,具体机制尚不完全清楚。陈斌等[7]研究发现,阿托伐他汀具有诱导血管壁平滑肌细胞凋亡的作用,并认为平滑肌细胞的凋亡不足是内膜损伤后导致管腔狭窄的重要因素。SAH发生后,特别是自发性动脉瘤性SAH必然有血管壁的损伤,引起血管壁平滑肌细胞的增殖,一旦血管壁平滑肌细胞的增殖与凋亡不能达到平衡,势必会造成血管腔的狭窄,从而引发一系列的症状。阿托伐他汀可以调节二者的动态平衡,从而达到对受累血管的解痉作用。本实验应用TUNEL法检测BA平滑肌细胞的凋亡指数,发现阿托伐他汀组明显高于SAH组,证明阿托伐他汀可以促进血管壁平滑肌细胞的凋亡。通过测量BA血管壁厚度与内径周长的变化也可以发现阿托伐他汀组较SAH组有所改善,说明阿托伐他汀对缓解SAH后CVS有一定的作用。Cheng等[4]研究也证实阿托伐他汀具有改善蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的作用。

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,受内在遗传机制控制自动结束生命的过程。细胞凋亡过程中起关键作用的 因素主 要有Caspase家族 、Bcl-2家族 、Fas、p53、C-myc、C-fos、C-jun以及线粒体。血管平滑肌细胞内Ca2+的稳定对血管平滑肌功能起着重要的调节作用,并且参与了平滑肌细胞的凋亡过程。尼莫地平通过对Ca2+的调控来影响细胞内Caspase-3与Bcl-2表达,从而调节细胞的凋亡[8]。阿托伐他汀能够增高血管平滑肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-M g2+-ATP酶活性[9],使细胞内Ca2+增加,引起细胞内Caspase-3与Bcl-2表达的变化,进而促进平滑肌细胞的凋亡。SAH后CVS是一个复杂的过程,是多种因素共同作用的结果,所以阿托伐他汀通过调节血管壁平滑肌细胞内Ca2+的变化来诱导平滑肌细胞的凋亡对缓解CVS具有一定的局限性。本实验结果显示假手术组与阿托伐他汀组血管壁厚度和内径周长差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。说明阿托伐他汀对缓解SAH后CVS虽有一定的作用,但并不能完全解除受累血管的痉挛状态,因此在临床中应该与其他药物联合应用。

此外,SAH后CVS的发生与血管内皮细胞产生的内皮衍生舒张因子和内皮衍生收缩因子的动态平衡有密切关系,NO是一种作用极强的血管舒张因子,可以对抗内皮素(ET)的缩血管作用,从而缓解CVS。据研究显示阿托伐他汀有增加一氧化氮的生物活性,对缓解SAH后CVS起到一定的作用[10]。本实验没有对阿托伐他汀的这一作用进行验证,可能与其对BA平滑肌细胞凋亡的调节共同起作用来绶解SAH后引发的CVS。

总之,阿托伐他汀通过上述途径来调节SAH后CVS,阿托伐他汀调节CVS的作用可能还有其他途径,尚需进一步研究。

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