不离心直接上游法优化精子用于夫精宫腔内人工授精

马征兵，闵保华，张永奇 ，罗亚宁

（1.河南省安阳市妇幼保健院生殖科,河南安阳 455000；2.第四军医大学唐都医院生殖医学中心,陕西西安 710038）

既往笔者探讨了多种精子优化法可选择应用于夫精宫腔内人工授精术前精液的体外处理，其中洗涤上游法适用于精液常规检查大致正常者[1]。近来笔者采用了一种新的精子优化法，即不离心直接上游法，实践表明，该法同洗涤上游法一样，可成功用于夫精宫腔内人工授精前精液的体外处理，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集的数据来自安阳市妇幼保健院生殖科和第四军医大学唐都医院生殖医学中心于2009年7月～2009年12月拟行夫精宫腔内人工授精丈夫精液体外处理前后的实验记录，丈夫精液常规检查大致正常者90例共130个周期。采用2种上游法按照随机原则对这90例不孕不育患者共130个周期进行精液体外优化，其中洗涤上游法70个周期，不离心直接上游法60个周期。标本采集时嘱丈夫禁欲3～7 d，于授精日手淫将精液完整取于一次性无毒无菌取精杯内，放无菌超净工作台内室温下直到精液完全液化后备用。

1.2 仪器与试剂

CO2培养箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州苏净公司），WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统 （北京伟力公司）；Diff-Quik快速染色试剂盒（广东友宁公司），Q-HTF精子洗涤和培养液（美国ZDL公司），G-IVFTM-plus精子处理和受精液（瑞典Vitrolife公司）。

1.3 精子动态与形态学检查

精子优化前，将已液化的精液按WHO实验室标准进行精液常规分析[2]；精子动态学主要参数（密度、活率、活力分级）采用WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统软件进行计算；精子形态学主要参数（正常形态精子百分率）采用人工计数方法计算。检查时，取0.5 ml精液加0.5 ml生理盐水充分混匀，用巴士德吸管吸取这1 ml稀释的精液滴片、拉薄技术制片2张，按照WHO推荐的Diff-Quik法进行染色；在光学显微镜油镜（×1 000）下，每张片至少读取200个精子，用严格判断标准进行判别；人工计数正常形态及畸形精子数，最后取2张片子结果的均数。

1.4 精子优化方法

洗涤上游法：向已液化的精液内加入等体积经37℃、5%CO2平衡过的Q-HTF精子洗液，充分混匀后400×g离心10 min，留管底精子沉淀加3 ml Q-HTF精子洗液再次混匀，300×g离心6 min，去除上清液后，向底部沉淀精子上方缓慢加入1.5 ml G-IVFTM-plus液，倾斜 45°置 37℃、5%CO2培养箱孵育40 min后，用无菌巴士德吸管吸取G-IVFTM-plus上层云雾状含精子的悬液1.0 ml，置于无菌小试管内，用可调移液器吸取5.0μl精子悬液做动态学检查，吸取50μl精子悬液滴片、拉薄技术制片、染色做形态学检查（方法同优化前），剩余标本待行宫腔内人工授精；不离心直接上游法：准备8～10个一次性无菌圆底试管，分别加入1ml经37℃、5%CO2平衡过的G-IVFTM-plus液，用可调移液器吸取8～10等份已液化的精液，直接缓慢地加在圆底试管底部G-IVFTM-plus液的下面，加样时不能产生气泡，然后将这8～10个圆底试管倾斜45°置37℃、5%CO2培养箱孵育1 h，之后用可调移液器向每个圆底试管吸取G-IVFTM-plus上层云雾状含精子的悬液各100μl，共收集上游液0.8～1.0 ml，置于无菌小试管内，同洗涤上游法取样做精子动态、形态学检查，剩余标本待行宫腔内人工授精。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差齐的成组t检验。

2 结果

90例共130个周期随机采用上述2种上游法处理精液后，精子的动态学主要参数，包括密度、活率、活力分级（a+b）较处理前相比均得到明显提高（均P＜0.05）；正常形态精子百分率与处理前比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不离心直接上游法优化后精子的主要参数与洗涤上游法优化后精子的主要参数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 2种上游法处理精液后精子主要参数的变化（x±s）

3 讨论

上游法和双层密度梯度离心法是目前精子优化处理常用的两种方法[3]。将精液进行离心是精液体外处理中共有的一项操作，尽管优选技术不会增加精子超微结构的损害，对精子染色体也没有产生影响，然而包括离心等环节对精液的体外处理可能会造成精子的物理损伤并形成损害性的过氧化物或其他氧自由基[4-5]，这些有害物质会造成精子DNA的损伤并影响精子染色质的完整性[6]。有报道不育男性精子染色体的畸变率明显高于体细胞染色体[7]，这可能与采取辅助生殖技术后有较高的不良妊娠结局密切相关[8]。因此，在保证临床妊娠率的前提下，如何使精子尽量处在一种接近生理状况下与卵子受精是值得探讨的一个问题。

本文介绍的不离心直接上游法，正是出于上述因素考虑而采取的一种精子体外优化的方法。由于上游法同密度梯度离心法相比，回收精子数量较低[1]，为了在不离心浓缩精子的情况下能够回收到相当数量活力好的精子，笔者将常规检查大致正常并且已充分液化的精液分为8～10等份，分别加样在G-IVFTM-plus受精液的下面，这样，有利于精液与受精液充分接触，相当于缩短了精子与受精液之间的距离，扩大了精子与受精液接触的面积；同时又延长了精子上游的时间，让活力好的精子充分上游。本实验结果表明，在不离心的情况下，同样可以回收到密度较高、活力较好的精子，与经过离心的洗涤上游法相比，精子动态与形态学主要参数的差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，本研究发现，采用这2种上游法优化精子后与优化前相比，正常形态精子百分率比较，差异也无统计学意义（P＞0.05），表明这2种上游法均不能有效去除畸形精子，可能是上游法使一些活力较好的畸形精子都得到了上游。尽管不离心直接上游法同时也增加了试剂和耗材的消耗，然而此方法减少了精液离心这一环节可能对精子造成的不利影响，并且缩短了精子在CO2培养箱外放置的时间，最终可以取得与经过离心的洗涤上游法同样的优化效果。另外，对那些少精子症而拟行夫精宫腔内人工授精的患者，笔者仍然采用双层密度梯度离心法。

总之，不离心直接上游法是完全依靠精子克服自身重力和精浆的黏滞阻力向上游动到受精液里的一种精子优化方法。本研究表明，对于常规检查大致正常的精液标本，可以考虑采用这种方法来优化精子。以后的工作中，笔者将扩大不离心直接上游法优化精子的样本例数，并将随访用此方法行夫精宫腔内人工授精后患者的妊娠率和妊娠结局。

[1]闵保华,罗亚宁,王晓红,等.3种精子优化法处理精子行宫腔内人工授精的结局分析[J].陕西医学杂志,2006,35(2):148-150.

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[3]Allamaneni SS，Agarwa A，Rama S，et al.Comparative study on density gradients and swim-up pmparation techniques utilizing neat and cryopreserved spermatozoa[J].Asian JAndrol,2005,7(1):86-92.

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[5]王娜.活性氧类物质对精子DNA的损伤及其检测[J].中国医药导报,2009,6(12):5-6.

[6]李红,杨学农,李文平.精子DNA损伤的研究进展及临床价值[J].中国计划生育学杂志,2008,16(9):575-576.

[7]葛宏兵,周惠耕.2203例不育男性染色体分析[J].中华实验外科杂志,2005,22(10):1222-1223.

[8]张青松,文波,陈敏.体外处理对精子形态的影响及妊娠结局的临床观察[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(7):83-88.