固态发酵生产裂褶菌多糖的动力学研究

裂褶菌多糖是从裂褶菌子实体、菌丝体或发酵液中提取出来的一种中性胞外多糖，是裂褶菌的主要功能成分，具有抑制肿瘤、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性[1]。裂褶菌作为一种药食用真菌，现已实现规模化固态发酵培养，研究裂褶菌多糖的固态发酵动力学，对于探讨其发酵机理、优化培养参数、提高工业化生产效率具有重要意义。作者在此对裂褶菌多糖的固态发酵动力学进行研究，以期得到各参数之间的关系模型，为固态发酵生产裂褶菌多糖实现工业化提供依据。

1 实验

1.1 菌种

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)50875 菌株，自行筛选保存。

1.2 培养基

斜面种子培养基：马铃薯培养基(PDA)[2]。

摇瓶种子培养基(g·L-1)：葡萄糖30，黄豆粉5，酵母浸膏粉2，KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,VB10.001。

固态发酵培养基：80%麦麸+20%玉米芯(初始含水量为50%)。

1.3 培养方法

首先将菌种接种到斜面培养基，于27℃培养6 d；再接种到液体种子培养基，于27℃、180 r·min-1下培养60 h；最后接种到固体培养基，于27℃培养8 d。

1.4 分析与检测

为了保证实验数据的可靠性，固体培养基统一制备、统一接种、混合均匀后分装到培养瓶中在同一培养箱中进行培养，取样时同时取3个培养瓶分别测定裂褶菌多糖含量、底物消耗量及菌体含量，取平均值。

1.4.1 裂褶菌多糖含量的测定

收集固态发酵物，60℃烘干6 h,粉碎；80℃水提，4200 r·min-1离心20 min，取上清液，加3 BV乙醇沉淀过夜；离心、收集醇沉物，定量分散；取分散液适当稀释，采用苯酚-硫酸法[3]测定总多糖含量。

1.4.2 底物消耗量的测定[4]

取不同发酵时间的培养瓶，将其中的固态发酵物于60℃烘干至恒重，准确称重，按下式计算底物消耗量。

1.4.3 菌体量的测定

菌体量的测定采用核酸法[5]。

1.5 计算工具软件

采用 Origin 8.0软件。

2 结果与讨论

2.1 裂褶菌多糖固态发酵过程中的代谢变化

对裂褶菌进行固态发酵培养，每隔1 d取样测定菌体生物量、多糖产量和底物消耗量，结果见图1。

图1 裂褶菌固态发酵过程代谢变化

由图1可以看出，裂褶菌固态发酵过程中，菌体生长曲线呈“S”型，多糖产量同菌体的生长同步。表明该发酵过程属于生长偶联型[6]。

2.2 固态发酵动力学模型的建立

借鉴药用真菌液体深层发酵的动力学模型，基于以下假设：(1)固态发酵反应器内温度和湿度等参数衡定，生物量、基质成分以及裂褶菌多糖的含量等亦均匀一致，即固态发酵反应器是一个理想的全混反应器；(2)菌体生长为均衡型非结构式生长，细胞成分仅需用一个参数即菌体浓度表示即可；(3)培养基中只有一种底物是细胞生长限制性底物，其它营养成分及氧气供应不影响微生物的生长；(4)将微生物生长视为简单反应[7，8]。

2.2.1 菌体生长动力学模型

菌体生长曲线呈“S”型，可以用Logistic模型[6,9]来描述，即：

(1)

式中：X为细胞浓度,g·(100 g)-1；Xmax为最大细胞浓度,g·(100 g)-1；μmax为最大比生长速率,d-1。

2.2.2 多糖合成动力学模型

已知裂褶菌多糖合成属于生长偶联型，根据微生物产物合成动力学Luedeking-Pirct模型[8,9]，得

(2)

式中：P为产物浓度，g·(100 g)-1；α为与菌体生长量关联的产物合成常数,g·(100 g)-1·d-1。

2.2.3 底物消耗动力学模型

常用的底物消耗动力学模型是基于底物消耗物料恒算建立的方程式[8]：

(3)

式中：YX/S=ΔX/ΔS，细胞对基质的得率系数，g·(100 g)-1；YP/S=ΔP/ΔS为产物对基质的得率系数，g·(100 g)-1；S为底物量，%；Ke为细胞维持系数，单位质量干细胞在单位时间内维持代谢消耗的基质量，g·(100 g)-1·d-1。

在固态发酵生成裂褶菌多糖的过程中，维持菌体代谢所消耗的底物量很有限，因此认为底物消耗主要用于菌体生长和多糖的合成，所以(3)式可以简化为：

(4)

2.3 动力学模型的求解拟合

2.3.1 菌体生长动力学模型求解

在式(1)中，t=0时，X=X0，积分得到：

Xt=X0exp(μmaxt)/{1-(X0/Xmax)[1-exp(μmaxt)]}

(5)

由实验数据直接读出X0=2.07 g·(100 g)-1、Xmax=6.82 g·(100 g)-1，以ln[Xt/(Xmax-Xt)]对时间t作图，其斜率即为μmax，得到μmax=0.7385 d-1。得到裂褶菌多糖固态发酵过程中菌体生长的动力学模型为：

Xt=2.07exp(0.7385t)/{1-0.3035[1-exp(0.7385t)]}

(6)

用Origin 8.0软件对裂褶菌菌丝体生长的实验数据进行非线性拟合，结果见图2，其中R=0.99256，表明所选模型准确地反映了菌体生长的实际情况。

图2 裂褶菌菌体生长拟合曲线

2.3.2 多糖合成动力学模型求解

将式(1)代入式(2)中，积分得：

Pt=P0+α(Xt-X0)

(7)

以Pt对(Xt-X0)作图,可得斜率α=1.9493，而P0=0 g·(100 g)-1,已知X0=2.07 g·(100 g)-1，那么多糖合成的动力学模型为：

Pt=1.9493(Xt-2.07)

(8)

对裂褶菌多糖产量的实验数据进行非线性拟合,结果见图3，其中R=0.99163，表明所选模型很好地反映了多糖合成的实际情况。

图3 裂褶菌多糖合成拟合曲线

2.3.3 底物消耗动力学模型求解

将式(1)代入式(4)中，积分得：

St=S0-b2(Xt-X0)

(9)

式中：b2=1/YX/S。

以St对(Xt-X0)作图，得：S0= 0.3766，b2=-0.6458，已知X0=2.07 g·(100 g)-1，得底物消耗的动力学模型为：

St=0.3766+0.6458(Xt-2.07)

(10)

对底物消耗的实验数据进行非线性拟合,结果见图4，其中R=0.98835，表明所选模型较好地反映了底物消耗的实际情况。

图4 底物消耗拟合曲线

3 结论

通过对裂褶菌多糖发酵过程的研究，发现裂褶菌菌体生长和多糖的合成属于生长偶联型，即随着菌体生长，底物被迅速利用，并在菌体生长过程中合成多糖。基于Logistic方程和Luedeking-Pirct方程，结合数学推导并应用Origin 8.0软件对实验数据进行处理计算，得到了菌体生长、多糖合成和底物消耗的动力学模型及其参数，结果表明该模型与实验数据能较好地拟合。

参考文献：

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[4] 熊晓辉，张李阳，韦策，等.固态发酵生产Monacolin K的动力学模型[J]．工业微生物，2003，33(4)：27-31．

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