阿魏酸与DNA相互作用的光谱电化学研究

DNA是重要的生命遗传物质和遗传载体，小分子生物活性物质与DNA相互作用是生物化学研究的前沿领域之一[1，2]，研究DNA与小分子之间的相互作用有助于深刻理解DNA与识别分子或药物分子的作用机理，对了解药物的作用机理，进而通过分子设计寻找有效的治疗药物等具有重要意义。凝胶电泳、印迹技术、紫外可见光谱、荧光光谱、原子力显微镜等已广泛应用于这项研究[1～4]。电化学方法[5～8]也越来越多地用于研究电氧化还原物质如抗癌物质与DNA的相互作用。

阿魏酸 (4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，Ferulic acid) 是一种植物多酚，普遍存在于中药材中，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化和自由基、调节免疫功能、利肝保湿等药理作用[9～11]。近年来，有关阿魏酸及其衍生物抑制DNA氧化损伤以及结肠癌、直肠癌和舌癌的报道不断增加[12～14]，其结构如图1所示。

图1 阿魏酸的结构式

作者利用多壁碳纳米管(MWNT)修饰玻碳电极(MWNT/GCE)研究了阿魏酸与DNA的相互作用，对二者之间的作用机理进行研究，拟为深入了解阿魏酸类药物的生物活性提供实验依据。

1 实验

1.1 试剂与仪器

阿魏酸溶液的配制：用二次蒸馏水配制成1.00×10-3mol·L-1的储备液，4℃以下贮存。

小牛胸腺DNA(Sigma)储备液：用二次蒸馏水配制成8 μg·mg-1的储备液，4℃以下贮存(小牛胸腺DNA简写为DNA)。

B-R缓冲溶液的配制[15]：在100 mL混合液[3.92 mg·L-1H3PO4(2.71 mL·L-185%正磷酸)、2.40 g 乙酸(2.36 mL·L-1冰醋酸)、2.47 g·L-1H3BO3]中，加入0.2 mol·L-1的NaOH溶液40.0 mL，调节pH值为5.72。

其它试剂均为分析纯或优级纯；二次蒸馏水。

三电极体系：工作电极为玻碳电极(GCE)，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂电极；MEC-12B型多功能电化学分析系统(江苏江分电分析仪器有限公司)；AS3120A型超声波清洗器；pH-213型酸度计。

1.2 MWNT/GCE的制备

MWNT/GCE的制备参考文献[16]，将MWNT在浓HCl中超声7.5 h进行纯化，纯化后的MWNT加浓HNO3在140℃下回流8 h，水洗至中性，在100℃烘干研成粉末。经浓HNO3回流处理后的MWNT，在打开其端口的同时，引入羧基和羟基官能团。

称取功能化的MWNT粉末10.0 mg，超声分散于10 mL水中，形成黑色悬浊液备用。玻碳电极先用0.05 μm Al2O3抛光粉抛光成镜面，然后分别在无水乙醇和二次水中超声清洗5 min。用微量进样器取4 μL悬浊液滴加在玻碳电极表面，红外灯下烘干，即得MWNT/GCE。

1.3 DNA的变性处理

DNA变性处理参考文献[17]，将8.0 μg·mg-1DNA置于70～100℃的水浴中约30 min，然后迅速置于冰浴中冷却，双链DNA (dsDNA)即解链变性为单链DNA(ssDNA)。

1.4 方法

在10 mL比色管中依次加入pH = 5.72的0.04 mol·L-1B-R缓冲溶液5 mL、1.00×10-3mol·L-1阿魏酸溶液3.0 mL、一定量的dsDNA或ssDNA，定容至10 mL，摇匀，静置一定时间。采用三电极系统，以0.10 V·s-1的扫描速度在0.8～0.0 V范围进行循环伏安分析。

2 结果与讨论

2.1 阿魏酸和dsDNA相互作用的电化学行为

图2是在pH=5.72的0.04 mol·L-1B-R缓冲溶液中，阿魏酸与dsDNA作用前后在MWNT/GCE电极上的循环伏安图。

a.dsDNA b.阿魏酸+dsDNA c.阿魏酸

从图2可知，含有8 μg·mg-1dsDNA的溶液在0.8～0.0 V范围内没有氧化还原峰产生；含有1.00×10-3mol·L-1阿魏酸的溶液在+0.36 V和+0.23 V产生氧化还原峰，峰电位差为13 mV，峰电流比ipa/ipc=0.872，表明阿魏酸电极过程为准可逆。

在阿魏酸中加入dsDNA溶液后，Epc正移，Epa=+0.40 V，Epc=+0.15 V，△Ep为25 mV；峰电流ip显著下降，表明阿魏酸与dsDNA相互作用时形成电活性较低的复合物。根据峰电位的位移可判断阿魏酸与dsDNA相互作用模式[18]，峰电位正移、峰电流下降，推测阿魏酸与dsDNA相互作用以嵌插作用为主。

为了进一步探讨阿魏酸与DNA的作用机理，将8.0 μg·mg-1dsDNA和8.0 μg·mg-1ssDNA分别与3.0×10-4mol·L-1阿魏酸相互作用，结果见图3。

a.dsDNA b.阿魏酸+dsDNA c.阿魏酸+ssDNA d.阿魏酸

从图3可知，dsDNA和ssDNA均使阿魏酸的峰电流降低。但是dsDNA氧化峰电位右移明显高于ssDNA，且峰电流降低更明显，这是因为阿魏酸可以平面芳香环嵌插到dsDNA的双螺旋结构中，电活性降低，而ssDNA不具备双螺旋结构，其峰电流降低和氧化峰电位正移的原因可能是静电作用所致。

2.2 DNA与阿魏酸相互作用的紫外吸收光谱

阿魏酸和dsDNA相互作用前后的紫外吸收光谱图见图4。

a.dsDNA b.阿魏酸 c～e.阿魏酸+dsDNA

从图4可知，阿魏酸在310 nm处有特征吸收峰，dsDNA在260 nm 处有最大吸收。在加入dsDNA后,阿魏酸在310 nm处的吸收峰降低，呈减色效应，且出现两个等电吸收点。鉴于dsDNA在310 nm处几乎没有吸收，因此阿魏酸在310 nm处的吸收变化是与dsDNA作用所致，减色效应及两个等电吸收点是嵌插作用的结果[19]。吸收光谱进一步说明阿魏酸与DNA的相互作用以嵌插作用为主。

2.3 相互作用电子转移系数α和表观电子传递速率常数ks的测定

电子转移系数α是电极反应能量势垒对称性的量度，对于准可逆体系，根据Laviron理论，应遵循关系式(1)[20，21]：

(1)

式中：Epc为还原峰电位；α为电子转移系数；n为实际电子转移系数；k为常数；R为气体常数；F为法拉弟常数；v为扫描速度，V·s-1。

电子转移系数α可由Epc～lgv关系曲线的直线斜率求得，还原峰电位Epc和v的常用对数lgv关系曲线的直线斜率应为-2.303RT/αnF。依相关数据求得-2.303RT/αnF为-0.2204。由此得αn=0.27，则n=1时，α=0.27。

表观电子传递速率常数ks可由式(2)[20，21]求得：

(2)

式中:ΔEp为还原峰电位与氧化峰电位的差值。由式(2)求得ks=0.17 s-1，阿魏酸与dsDNA作用前后的电化学参数变化见表1。

表1 阿魏酸与dsDNA作用前后的电化学参数变化

由表1可见，3.0×10-4mol·L-1阿魏酸与8.0 μg·mg-1dsDNA作用后,α、ks值有所下降，说明阿魏酸与DNA的复合物是非电活性的，可能的原因是阿魏酸嵌插到dsDNA的双螺旋结构中，电活性点被屏蔽，导致电子转移和传递能力降低。

2.4 相互作用的结合常数β和结合数m

根据参考文献[20，21]计算阿魏酸与DNA相互作用的结合常数β和结合数m。

假定阿魏酸(用A表示)和DNA只形成一种简单的复合物dsDNA-mA，则反应式和结合常数如下：

dsDNA+mA→dsDNA-mA

(3)

式中:cA0为阿魏酸的初始浓度。经推导可得式(4)：

(4)

式中:Δipa,max为加入dsDNA前后Δipa的最大值。

综上可知，阿魏酸和DNA之间由于阿魏酸嵌入DNA的碱基对间形成了DNA-阿魏酸的简单缔合物，即1 mol DNA碱基对结合了1 mol的阿魏酸分子。

3 结论

在pH=5.72的B-R缓冲溶液中，阿魏酸和DNA发生嵌插作用形成非电活性的分子化合物DNA-阿魏酸。通过比较电子转移系数α和表观电子传递速率常数ks的变化，可从理论上说明阿魏酸和DNA发生相互作用；通过紫外吸收光谱分析对二者的嵌插作用进行了验证。求得阿魏酸和DNA嵌插作用的结合常数β为1.01×104，结合数m≈1。

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