壳聚糖对桑叶水提液的絮凝工艺研究

桑叶为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶，其药用价值最早见于《神农本草经》，性味甘、苦、寒，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的作用，主要用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花等症的治疗[1]。现代药理研究发现，桑叶具有降血糖、降血脂、降血压、调节免疫、抗肿瘤、延缓衰老、抗凝血、抑菌、抗炎等多种药理活性，其主要药效成分是黄酮和多糖。我国桑叶资源较丰富，在药品和功能性食品方面有着广阔的研究与开发前景。

壳聚糖具有良好的生物降解性和生物可溶性，既能除去杂质，又能保证药液或制剂稳定，已广泛应用于中药药液及制剂的澄清精制[2～4]。壳聚糖作为一种新型的天然絮凝剂，其澄清作用机理是利用电荷和大分子的架桥作用，去除溶液中的不溶性颗粒和鞣质、蛋白质、树脂等杂质，得到澄清的溶液[5,6]。

作者在此采用壳聚糖絮凝桑叶水提液，以有效成分总黄酮和总多糖含量为指标对絮凝工艺进行全面考察，筛选出了最佳絮凝工艺条件。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

干桑叶(批号：20070920)，河北安国京兴药业有限责任公司。

葡萄糖，天津北方天医化学试剂厂；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所；壳聚糖，上海伟康生物制品有限公司；其余试剂均为分析纯。

KDM型调温电热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；FA1004型电子天平、UV762型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣仪器厂；PHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；电子恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑叶水提液的制备

称取桑叶100 g，加水煎煮2次，第1次加入10 BV水，煎煮2 h；第2次加入8 BV水，煎煮1 h。合并两次滤液，减压浓缩至规定浓度，即得桑叶水提浓缩液，用时加水稀释。

1.2.2 壳聚糖溶液的制备

用1%的冰醋酸溶液配制1%的壳聚糖溶液，充分溶胀后作为絮凝剂立即使用，以免在稀酸中缓慢水解而影响絮凝效果。

1.2.3 壳聚糖絮凝桑叶水提液

量取桑叶水提液适量，调pH值至规定值，加入一定量壳聚糖溶液，搅拌10 min，在一定水浴温度下放置一段时间，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总多糖和总黄酮含量。

1.2.4 多糖标准曲线绘制及样品中总多糖含量测定

葡萄糖对照品溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，即得1 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液，摇匀，备用。

蒽酮试剂的配制：精密称取0.2 g蒽酮溶于100 mL 72%硫酸中(须临用新配)。

多糖标准曲线的绘制：精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。精密吸取该溶液1.0 mL置于具塞试管中，沿试管壁分别加入5 mL 0.2%蒽酮试剂，混匀，盖上玻璃塞；置沸水浴中加热10 min，取出；在冷水浴中冷却20 min；在626 nm处，以空白试剂调零，测定各溶液的吸光度。以吸光度(A)为纵坐标、浓度(c)为横坐标绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程A=4.845c+0.019，R2=0.999，线性范围为0.2～1.4 mg·mL-1。

样品液总多糖含量的测定：将絮凝后滤液减压浓缩，冷却，加入95%乙醇至醇含量达75%，其间不断搅拌，有大量沉淀生成，离心，收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤， 得到粗多糖。粗多糖用适量热蒸馏水溶解后，放冷；转移至50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。精密吸取该溶液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，待测。从各组桑叶多糖供试液中分别精密吸取1.0 mL，置于具塞试管中，按照“多糖标准曲线的绘制”项下的方法测定吸光度，并根据多糖标准曲线计算样品液中总多糖的含量。

1.2.5 黄酮标准曲线绘制及样品中总黄酮含量测定

芦丁对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，置于100 mL烧杯中，加适量60%乙醇，水浴微热，使之溶解，放冷，转移至100 mL容量瓶中，加入60%乙醇至刻度，即得0.2 mg·mL-1芦丁对照品溶液，摇匀，备用。

黄酮标准曲线的绘制[7,8]：精密吸取芦丁对照品溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中； 加30%乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min； 加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min；加4% NaOH溶液10 mL，再加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min；在波长510 nm处，以空白溶液作参比，测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标、浓度(c)为横坐标绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程A=12.782c-0.0519，R2=0.999，线性范围为0.2～1.0 mg·mL-1。

样品液总黄酮含量的测定：精密吸取絮凝后滤液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容，摇匀。精密吸取该溶液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按照“黄酮标准曲线的绘制”项下的方法测定吸光度，并根据黄酮标准曲线计算样品液中总黄酮的含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 壳聚糖加入量对絮凝效果的影响

取桑叶水提浓缩液适量，加水稀释至桑叶水提液质量体积比为1∶10(g∶mL，下同)，调pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，分别按0.4 mL·g-1(壳聚糖溶液体积/生药量，下同)、0.8 mL·g-1、1.2 mL·g-1、1.6 mL·g-1、2.0 mL·g-1加入不同量的壳聚糖溶液，搅拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总黄酮和总多糖含量。结果见图1。

图1 壳聚糖加入量对总黄酮和总多糖含量的影响

由图1可看出，随着壳聚糖加入量的增加，总多糖与总黄酮的含量均有所上升，但当壳聚糖加入量大于1.2 mL·g-1时，总多糖和总黄酮含量均有所下降。这是因为随着壳聚糖加入量的增加，壳聚糖与蛋白质、鞣质等杂质分子发生吸附架桥和电中和的机会增大，使得蛋白质、鞣质等杂质分子被大量絮凝沉淀，提高了总黄酮和总多糖的含量；但是，随着壳聚糖用量的进一步增加，过多的絮凝剂可能引起药液自身稳定性被破坏，黄酮和多糖等有效成分随大分子物质一起沉降，导致含量降低。因此，壳聚糖加入量以1.2 mL·g-1为宜。

2.1.2 桑叶水提液质量体积比对絮凝效果的影响

取桑叶水提浓缩液适量，加水稀释至桑叶水提液质量体积比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(药液体积按每份含生药12.5 g进行调整)，调pH值至6.0，按1.2 mL·g-1加入壳聚糖溶液，搅拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总黄酮和总多糖含量。结果见图2。

图2 桑叶水提液质量体积比对总黄酮和总多糖含量的影响

由图2可看出，随着桑叶水提液质量体积比的降低，总多糖与总黄酮含量逐渐增加。这是因为当桑叶水提液质量体积比较高时，有效成分可能被所形成的沉淀吸附、包裹，使得总多糖和总黄酮含量降低；但桑叶水提液质量体积比小于1∶10时，随质量体积比的降低，总多糖和总黄酮含量反而降低，这与壳聚糖浓度降低，影响了药液絮凝效果有关。因此，桑叶水提液质量体积比以1∶10为宜。

2.1.3 药液pH值对絮凝效果的影响

取桑叶水提浓缩液适量，加水稀释至桑叶水提液质量体积比为1∶10，平行5份，每份100 mL，调pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1.2 mL·g-1加入壳聚糖溶液，搅拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总黄酮和总多糖含量。结果见图3。

图3 药液pH值对总黄酮和总多糖含量的影响

由图3可看出，当药液pH值小于6.0时，总黄酮和总多糖含量均随pH值的增大而增加。这是因为pH值较低时部分多糖在酸性条件下水解，壳聚糖的-NH2与H+结合，影响了壳聚糖的絮凝沉淀作用，此时增大pH值对絮凝有利。当药液pH值大于6.0时，随着pH值的增大，药液中的负电荷增加，减弱了壳聚糖的电中和作用，影响了絮凝作用的发生，总黄酮和总多糖含量迅速下降。因此，药液pH值以6.0为宜。

2.1.4 水浴温度对絮凝效果的影响

取桑叶水提浓缩液适量，加水稀释至桑叶水提液质量体积比为1∶10，调pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，按1.2 mL·g-1加入壳聚糖溶液，搅拌10 min，分别于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃恒温水浴中放置3 h，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总黄酮和总多糖含量。结果见图4。

图4 水浴温度对总黄酮和总多糖含量的影响

由图4可看出，随着水浴温度的升高，溶液中的胶体颗粒与壳聚糖分子相互碰撞的几率增大，加速了絮凝沉淀的形成，有利于药液的絮凝作用，总黄酮和总多糖含量相应增加；但是，当水浴温度过高时，形成的絮凝体细小，絮凝团体积大，含水量高，难于处理，易使壳聚糖高分子发生老化，影响絮凝效果。因此，水浴温度以45℃为宜。

2.1.5 絮凝时间对絮凝效果的影响

取桑叶水提浓缩液适量，加水稀释至桑叶水提液质量体积比为1∶10，调pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，按1.2 mL·g-1加入壳聚糖溶液，搅拌10 min，分别于45℃水浴中放置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，离心15 min(3000 r·min-1)，滤过，取滤液测定总多糖和总黄酮含量。结果见图5。

图5 絮凝时间对总黄酮和总多糖含量的影响

由图5可看出，随着絮凝时间的延长，壳聚糖与药液中的胶体颗粒、蛋白质等杂质作用时间延长，壳聚糖的絮凝作用充分，形成稳定的沉淀，总黄酮和总多糖含量相应增加；絮凝时间超过3 h后，总黄酮和总多糖的含量维持稳定,这是因为壳聚糖的作用达到了平衡，再延长絮凝时间对有效成分含量的提高无明显改善。因此，絮凝时间以3 h为宜。

2.2 正交实验[8]

根据单因素实验结果，絮凝时间对絮凝效果的影响较小，因而，分别以壳聚糖加入量、桑叶水提液质量体积比、水浴温度、药液pH值为考察因素，进行L9(34)正交实验，以确定壳聚糖的最佳絮凝条件。结果与分析见表1。

表1 正交实验结果与分析

由表1可知，各因素对絮凝效果的影响大小依次为：壳聚糖加入量>药液pH值>桑叶水提液质量体积比>水浴温度。综合考虑各因素，选择最佳工艺条件为A2B2C2D1，即壳聚糖加入量1.2 mL·g-1、桑叶水提液质量体积比1∶10、药液pH值6.0、水浴温度35℃。

2.3 验证实验

就最佳工艺条件下壳聚糖对桑叶水提液的絮凝效果进行验证，结果见表2。

由表2可知，在最佳工艺条件下，总多糖和总黄酮含量及综合评分均有所增加，说明所确定的最佳工艺条件适合桑叶有效成分的提取。

表2 验证实验结果/mg·mL-1

3 结论

通过单因素实验和正交实验，确定壳聚糖絮凝精制桑叶水提液的最佳工艺条件为：桑叶水提液质量体积比1∶10(g∶mL)、药液pH值6.0、壳聚糖加入量1.2 mL·g-1、水浴温度35℃、絮凝时间3 h。在此条件下，总黄酮和总多糖的平均含量分别为27.46 mg·mL-1、51.15 mg·mL-1，综合评分为39.32 mg·mL-1，说明此最佳工艺有利于桑叶水提液有效成分的提取。

参考文献：

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