2,4-二硝基苯肼显色法测定环己酮含量

环己醇及其衍生物是医药、农药、有机化工领域的重要中间体，如：4-(4-氯代苯基)环己醇是制备阿托喹酮等多种医药和多种液晶材料的重要中间体[1]，反式4-乙酰氨基环己醇是合成新型祛痰药盐酸氨溴索登的医药中间体[2]。虽然取代环己醇在很多天然物质中普遍存在，但是关于通过生物催化方法，特别是利用基因工程的方法构建还原环己酮类衍生物的生物催化剂的报道甚少[3]。

2006年，Bali等[4]在大肠杆菌中异源表达了糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1中的酮还原酶域基因，研究表明该酶域对环己酮类衍生物有较强的活性，且可通过定向进化技术提高该酶域的还原能力。但是该研究在筛选目标突变型菌株时，采用的是96孔板高通量筛选方法，通过监测NADPH在340 nm处吸光度的变化，来获得对环己酮衍生物还原能力提高的重组菌株，工作繁琐。

目前国内测定环己酮的方法主要有气相色谱法[5]、糠醛显色法[6]等。作者参考文献[7]，利用2,4-二硝基苯肼显色法测定重组菌株未还原的环己酮的含量，来初步筛选还原环己酮能力提高的突变重组菌。2,4-二硝基苯肼显色法测定环己酮含量，操作简便，检测结果可靠，对仪器要求也不高，可大大简化定向进化筛选环己酮还原能力强的突变株的工作。

1 实验

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌EscherichiacoliBL21、pET-28a质粒，安徽大学张部昌教授惠赠；异源表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1酮还原酶域基因的重组大肠杆菌E.coliBL21 (pET-eryKR1)2及异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coliBL21 (pET-gdh) 1，自行构建保藏。

1.2 培养基

LB培养基参考文献[8]配制,筛选抗性菌株时,加卡拉霉素至终浓度100 μg·mL-1。

1.3 试剂

环己酮(色谱纯)，上海晶纯化学试剂厂；2,4-二硝基苯肼(分析纯)、环己醇(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酶的诱导表达

E.coliBL21 (pET-eryKR1)2或E.coliBL21 (pET-gdh) 1菌株按5%的接种量接入30 mL LB培养基中，37℃培养约3 h(OD=1.0左右)，加入1 mmol·L-1IPTG诱导酶，继续培养4 h后，于4℃、4000 r·min-1离心10 min，获得的菌体用0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH值7.4)悬浮洗涤数次，离心，收获菌体。

1.4.2 重组菌催化还原环己酮

取0.2 gE.coliBL21 (pET-eryKR1)2[或作为阴性对照的E.coliBL21 (pET28a)]和0.05 gE.coliBL21 (pET-gdh)1悬浮于10 mL 0.1 mol·L-1的磷酸钾缓冲溶液(pH值7.4)中，再加入0.025 g葡萄糖及10 mmol·L-1环己酮底物。30℃、100 r·min-1振荡反应6 h后，于4℃、4000 r·min-1离心10 min，取上清液，测环己酮含量。

1.4.3 环己酮含量的测定方法

2,4-二硝基苯肼试剂的配制：取2,4-二硝基苯肼1 g，加入7.5 mL浓硫酸，溶解后将此溶液慢慢倒入75 mL 95%乙醇中，用水稀释至250 mL。

取25 μL环己酮上清液加入到试管中，再加入100 μL 2，4-二硝基苯肼试剂，沉淀充分后，加入5 mL 0.8 mol·L-1的氢氧化钠溶液，混匀，测吸光度。

1.4.4 检出限和精密度的测定

检出限和精密度的测定参照文献[6]和[9]。平均数X0、标准差s及相对标准差CV根据文献[6]计算。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

对环己酮和2,4-二硝基苯肼反应生成的苯腙衍生物以及2,4-二硝基苯肼进行全波长扫描，结果如图1所示。

图1 环己酮苯腙衍生物(a)和2,4-二硝基苯肼(b)的紫外分光光谱

由图1可知，苯腙衍生物的最大吸收峰在428 nm，而2,4-二硝基苯肼在428 nm波段之后的吸收值比较小，在520 nm之后几乎为0。因此，选择2,4-二硝基苯肼显色法检测环己酮的扫描波长为520 nm。

取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 10 mmol·L-1环己酮样品加入到试管中，再加入100 μL 2,4-二硝基苯肼试剂，沉淀充分后，加入5 mL 0.8 mol·L-1氢氧化钠溶液，混匀，以蒸馏水作为空白对照，在520 nm处测吸光度。以环己酮浓度(mg·L-1)为横坐标、OD520值为纵坐标，绘制环己酮的标准曲线，如图2所示。拟合线性回归方程为：y=0.1257x+0.019，R=0.9973。

图2 环己酮的标准曲线

2.2 重组菌还原环己酮的量的检测

经IPTG诱导的E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株，以环己酮为底物按1.4.2方法进行生物催化还原，测得还原后剩余环己酮与2，4-二硝基苯肼形成的苯腙衍生物的OD520为0.349，而阴性对照E.coliBL21 (pET28a)对应的OD520为0.637，进一步计算得出：经E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株催化还原后，环己酮的剩余浓度为538.19 mg·L-1(10 mL的转化液中)，而已知环己酮初始浓度为981.4 mg·L-1(即10 mmol·L-1)，故还原环己酮的转化率为45.2%。这与利用气相色谱法分析E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株还原环己酮的转化液，根据峰面积测得的该菌株还原环己酮的转化率基本一致。由此可见，通过在520 nm处检测环己酮和2,4-二硝基苯肼反应的环己酮苯腙衍生物的吸光度，再根据环己酮的标准曲线y=0.1257x+ 0.019，可推测体系中未被还原的环己酮的量，从而获得转化率。

2.3 检出限

对520 nm处测定的7个空白值(如表1)进行统计计算，得X0=-0.107，s=0.00786，检出限L0=3s/K=3×0.00786/0.1257 =188 μg·L-1。

表1 检出限测量数据

2.4 精密度

对一定浓度的二硝基苯腙样品进行精密度实验，在520 mn处测定5个二硝基苯腙吸光度(表2)，计算得标准差SD=0.0115，而相对标准差CV=1.52%。

表2 精密度测量数据

3 结论

建立了利用环己酮和2,4-二硝基苯肼显色反应来检测环己酮含量的方法，环己酮浓度在0～5 mg·L-1范围内与吸光度线性关系良好，线性方程为：y=0.1257x+0.019，R=0.9973。在10 mL转化液的实验条件下，方法的检出限为188 μg·L-1，相对标准差为1.52%。该方法操作简便、灵敏度较高、结果可靠，能满足筛选突变体的要求。

参考文献：

[1] 王继华，王焕杰，马振东，等.4-(4-氯苯基)环己醇及4-(4-氯苯基)环己酮的合成研究[J].精细化工中间体，2007，37(2)：48-51.

[2] 杨能渭，徐正林.4-乙酰氨基环己醇的顺反立体异构化工艺[J].高校化学工程学报，2002，16(2)：189-193.

[3] de Conti R M,Porto A L M,Augusto J,et al.Microbial reduction of cyclohexanones[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2001,11(4): 233-236.

[4] Bali S,O'Hare H M,Weissman K J.Broad substrate specificity of ketoreductases derived from modular polyketide synthases[J].Chem Bio Chem,2006,7(3):478-484.

[5] 史永松，顾海东．气相色谱法测定环境空气中的环己酮[J]．环境监测管理与技术，2002，14(2)：92.

[6] 杭士平．空气中有害物质的测定方法(第二版)[M]．北京：人民卫生出版社，1986:1-558.

[7] 尹济群，刘名才，冯敬池，等．2,4-二硝基苯肼显色法测定血细胞丙酮酸激酶[J]．临床检验杂志，1995，13(3)：127-128.

[8] Sambrook J,Frisch E F,Maniatis T．Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed)[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992.

[9] 张素荣，潘巍慧．纳氏试剂比色法在微量氨测定中存在的问题及改进建议[J]．环境工程，2005，23(5)：65-66.