CXCR4在神经母细胞瘤细胞SK-N-SH上的表达及其对化疗敏感性研究Δ

孙 婧，肖 燕，李 良，余素明，唐锁勤(.解放军总医院第一附属医院，北京市 00037;2.解放军总医院儿科，北京市 00853)

趋化因子是一类能够引起白细胞直接迁移的细胞因子，趋化因子及其受体之间形成一种复杂的趋化因子网络，影响肿瘤细胞的生长、存活、迁移、血管形成以及肿瘤部位的白细胞浸润［1～2］。趋化因子表达谱很广，包括树突状细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞等，不同细胞有不同的趋化因子受体表达，同一细胞可表达多种不同的趋化因子受体，同一趋化因子受体也可表达于不同细胞并对不同的趋化因子作出应答，因而形成一种复杂的网络，即趋化因子网络(Chemokine network)，发挥着多种生物学功能:介导白细胞迁移、调控血管生成、维持免疫稳定并参与次级淋巴器官的构建。在肿瘤生物学中具有生长因子作用、调节血管生长作用并参与肿瘤的白细胞浸润和转移等［3～5］。探讨趋化因子网络在肿瘤生长、转移中的作用机制必将为寻求新的肿瘤防治途径提供实验依据。

CXCR4，即CD184，是最常见的一种表达于不同类型恶性肿瘤细胞上的趋化因子受体，目前已经知道至少有23种以上的人类上皮性、间叶性和血液源性肿瘤细胞表达 CXCR4。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)是目前唯一已知的 CXCR4配体［6］。目前已经明确 SDF-1/CXCR4生物学轴与肿瘤的发生、生长、转移有密切的关系。趋化因子能募集特定的白细胞到炎症区。如果趋化因子持续高表达，有可能会造成广泛的组织损伤，增加癌变的概率。肿瘤可以自主分泌或者旁分泌SDF-1并表达其受体CXCR4，刺激肿瘤的生长，也可以通过促进血管生成来促进肿瘤的生长。另一方面，SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥重要作用［7］。如AML患者的白血病细胞表面有不同程度的CXCR4表达，SDF-1/CXCR4在白血病细胞迁移定位中发挥重要作用［8］。鉴于 CXCR4在肿瘤发生、生长及转移中均发挥重要作用，因此该分子目前成为肿瘤学防治领域的研究热点。

神经母细胞瘤是最常见的外周神经系统恶性肿瘤，起源于胚胎期的原始神经嵴，由未分化的交感神经细胞所组成。在儿童恶性肿瘤发病率中占第4位，仅次于白血病、脑瘤、淋巴瘤。据估计我国每年新发病3 000例［9］。其恶性程度高，早期转移是其最显著的生物学特征，诊断时以Ⅲ、Ⅳ期多见，预后较差［10］。因此寻找与之转移相关的基因对神经母细胞瘤患儿预后判断和治疗有重要作用。如前所述，目前已经明确CXCR4是一种重要的参与肿瘤发生、生长及转移的趋化因子受体，但对于该分子是否也表达在神经母细胞瘤细胞表面，以及是否与神经母细胞瘤的发生、生长及转移相关是目前尚不清楚的课题。

为了深入认识神经母细胞瘤细胞的生物学功能，本研究以神经母细胞瘤细胞SK-N-SH为研究对象，分别用流式细胞术(FACS)、MTT、Real-time PCR等方法检测了 CXCR4在SK-N-SH上的表达，分析了化疗药物 CTX、THP对肿瘤细胞SK-N-SH上CXCR4表达的影响。深入探讨CXCR4在神经母细胞瘤细胞中的生物学规律必将为该类肿瘤的特异性防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞SK－N－SH来源及其培养

神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH由美国洛杉矶儿童医院Stuart Elliott Siegel教授惠赠。采用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养、传代。实验用对数生长期细胞，台盼蓝拒染率在95%以上。

1.2 化疗药物名称及来源

注射用环磷酰胺(CTX)，分子量261.09，0.2 g/瓶，加氯化钠注射液稀释成0.1M分装待用，山西普德药业公司，国药准字 H14023686;注射用盐酸吡柔比星(THP)，10 mg/瓶，加氯化钠注射液稀释成2 mg·mL-1分装待用，深圳万乐药业有限公司，国药准字H10930105。4℃冰箱保存。

1.3 主要试剂和仪器

TRIZOL reagent(invitrogen公司，美国);氯仿、异丙醇、酒精(北京化工厂);DEPC水(sigma);RPMI 1640培养基(GiBCO);胎牛血清(北京元亨金马生物技术有限公司);PCR试剂、RNA反转录试剂盒、SYBR GREEN Real-time PCR试剂盒(TOYOBO公司，日本);CO2培养箱(Thermo美国);超净台(北京昌平长城空气净化公司);紫外分光光度计(Beckman DU-640);电泳系统(Thermo EC);恒温水浴箱(Thermo forma);酶联检测仪(Bio-Rad);恒压恒流 DFD电泳仪(国产);流式细胞仪(BD);Real-time PCR分析仪(MX3000)。

1.4 对化疗药物敏感性的检测

采用MTT比色法检测化疗药物对SK-N-SH细胞增殖的影响。接种1×104个细胞于96孔板中，100 μL/孔。参考文献所用的浓度，CTX浓度自0.03 mol·L-1起倍比稀释，THP浓度自0.67 μg·mL-1起10倍稀释，共设5～6梯度，每组设3个复孔，与细胞共培养1天后进行MTT检测。每孔加入10 μL MTT(5 mg·L-1)溶液，继续培养4 h，弃上清，每孔加入100 μL［0.01 M HCL+10%十二烷基磺酸钠(SDS)］，培养过夜，以全自动酶标仪在570 nm波长下检测各孔吸光度值(OD)，以药物浓度为横轴，以吸光度值为纵轴绘制量-效曲线。

1.5 流式细胞术(FACS)检测

CXCR4在SK-N-SH上的表达 CXCR4抗体购自eBioscience公司。收集 SK-N-SH细胞，1X106/样本，加PE-标记的CXCR4抗体1 μL/管，避光冰浴30分钟，其后，加入1 mL FACS洗液(含2%FCS、0.1% 叠氮钠的 PBS溶液)洗一次，弃去未结合的抗体，加入300～400 μL多聚甲醛溶液中固定。然后用流式细胞仪进行检测。

1.6 Real－time PCR检测

CXCR4在SK-N-SH中的表达:常规方法提取SK-NSH细胞的RNA，确定 cDNA反转录成功后，取1 μL cDNA作为模板，利用Real-time PCR试剂盒扩增目的基因片断。用相应的Real-time PCR结果分析软件，分析结果得出结论。人CXCR4特异性引物序列如下:CXCR4 Sence:CGTGCCCT CCTGCTGACTATT;Antisence:GCCAACCATGATGTGCTGAA人GAPDH:Sence:AATGGAAATCCCATCACCATCT;antisence:CGCCCCACTTGATTTTGG。

1.7 统计方法

对于单个检测指标的分析采用“具有一个重复测量的单因素设计定量资料方差分析”，在此基础上采用两两比较的Dunnett t检验统计分析对照组与各实验组两两之间的差异，P＜0.05认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 肿瘤转移相关趋化因子受体CXCR4在SK－N－SH上的表达

为了探讨相关趋化因子受体CXCR4在神经母细胞瘤生长及转移中的作用，我们首先用FACS及PCR两种方法检测了CXCR4在神经母细胞瘤细胞SK-N-SH上的表达。我们的结果显示，SK-N-SH上高表达 CXCR4分子(图1)，这为我们进一步探讨CXCR4与神经母细胞瘤细胞生物学的关系奠定了良好的基础。

图1 FACS及PCR方法鉴定CXCR4在神经母细胞瘤细胞SK－N－SH上的表达Fig 1 Expression of chemokine receptor CXCR4 on neuroblastoma cells－ SK－N－SH detected by FACS and PCR

2.2 CTX，THP两种药物对SK－N－SH的影响曲线

为了探讨CXCR4对神经母细胞瘤细胞SK-N-SH生物学活性可能的影响，我们首先探讨了常规化疗药物是否影响CXCR4在SK-N-SH上的表达。为此我们用 MTT的方法滴定了化疗药物CTX、THP对两种神经母细胞瘤细胞 SK-NSH的杀伤曲线，结果如图2所示。结果表明SK-N-SH细胞对 CTX的敏感区间是:3.75 mmol·L-1到15 mmol·L-1(图2A);SK-N-SH细胞对THP的敏感区间是:＞67 ng·mL-1(图 2B)。

图2 神经母细胞瘤细胞SK－N－SH对两种化疗药物CTX、THP的敏感区间测定Fig 2 Detection of the sensitivity of neuroblastoma cells－ SK－N－SH to CTX and THP

2.3 CTX，THP两种药物对SK－N－SH上 CXCR4表达的影响

图3 FACS检测化疗药物CTX、THP对神经母细胞瘤细胞SK－N－SH上 CXCR4表达的影响Fig 3 Effects of CTX and THP on the expression of chemokine receptor CXCR4 neuroblastoma cells－SK－N－SH detected by FACS

在接下来的实验中我们用FACS的方法检测了CTX，THP两种药物以及两种药物联合是否影响SK-N-SH上CXCR4的表达。结果如图3所示。我们的实验结果显示化疗药物CTX，THP均未能显著降低SK-N-SH细胞上CXCR4的表达(P＞0.05)，二者未出现明显的协同作用。

2.4 CTX、THP两种药物对 SK－N－SH上 CXCR4表达的影响

为了进一步验证 CTX，THP两种药物是否也在基因水平影响了SK-N-SH上CXCR4的表达我们进行了Real-time PCR检测，结果如图4所示。显示化疗药物 CTX、THP均未能显著降低SK-N-SH细胞上CXCR4的表达(P＞0.05)，二者未出现明显的协同作用。

图4 Real－time PCR鉴定化疗药物 CTX、THP对SK－N－SH神经母细胞瘤上CXCR4的表达Fig 4 Effects of CTX and THP on the expression of chemokine receptor CXCR4 on neuroblastoma cells－ SK－N－SH detected by Real－time PCR

3 讨论

趋化因子网络与肿瘤细胞的发生、生长及转移过程密切相关［11～14］。认识不同情况下趋化因子及其受体在肿瘤细胞的表达变化必将为肿瘤的免疫学防治提供实验依据。趋化因子受体CXCR4广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，并与肿瘤转移相关。我们前期的研究发现神经母细胞瘤细胞LA-N-5上高表达CXCR4分子，且化疗药物CTX、THP能显著影响该分子的表达［12］，但对于其他类型及来源的神经母细胞瘤细胞是否也存在类似的现象是我们非常关注的课题。

神经母细胞瘤是儿童时期最常见的恶性实体肿瘤，约50%的患儿诊断时就有转移症状［15］，骨髓是其重要的转移部位，大部分Ⅳ期神经母细胞瘤存在不同程度的骨髓受累［16］，神经母细胞瘤转移的机制不清，可能与骨髓微境有关［17］。目前经强烈的诱导化疗、手术切除、局部放疗、自体骨髓干细胞移植、13- 顺维甲酸生物治疗等其5年无病生存率也仅40%［18］，因此如果能做到早期诊断、早期治疗，将对改善神经母细胞瘤预后起到一定作用。

为了深入认识神经母细胞瘤细胞的生物学功能，本研究以神经母细胞瘤细胞SK-N-SH为研究对象，首先用流式细胞术(FACS)及PCR等方法在蛋白及基因水平检测了 CXCR4在SK-N-SH上的表达，结果如图1所示，结果表明神经母细胞瘤细胞SK-N-SH高表达CXCR-4分子，这为我们进一步探讨CXCR4与神经母细胞瘤细胞生物学的关系奠定了良好的基础。在接下来的研究中，我们用 MTT的方法滴定了两种化疗药物CTX、THP对 SK-N-SH细胞的剂量 -效应曲线(图2)，并用亚适剂量化疗药物 CTX、THP作用于上述肿瘤细胞。我们的结果表明与LA-N-5细胞不同，化疗药物 CTX、THP对SK-N-SH上CXCR4的表达无显著影响，提示不同肿瘤细胞对不同化疗药物的敏感性不同(图3)。

为了检测 CXCR-4在基因水平的变化，我们用 Realtime PCR方法分析了化疗药物对CXCR4表达的影响。结果表明THP及CTX在非致死浓度下，未能显著降低SK-N-SH上CXCR4的表达(P＞0.05)，且二者同时存在的情况下，也未出现协同效应(图4)。

通过上述研究，我们明确了转移相关趋化因子受体CXCR4在神经母细胞瘤SK-N-SH上的表达及其对化疗敏感性，与神经母细胞瘤 SK-N-SH不同，我们发现化疗药物CTX、THP不能影响神经母细胞瘤SK-N-SH上 CXCR4的表达，提示尽管表达相同的分子，不同来源的神经母细胞瘤对化疗药物的敏感性不同。本研究进一步明确了神经母细胞瘤细胞发生发展的个性化差异。

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