白色念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖抗肿瘤细胞的实验研究

陶佳 崔进

恶性肿瘤是影响人类身心健康和引起人类疾病死亡的主要原因，目前治疗恶性肿瘤的方法有消化道反应、造血功能抑制等明显毒副作用，令患者痛苦，且治疗不彻底，复发率高，因此开发高效低毒的抗肿瘤药物具有必要性和重要性。白色念珠菌是一种条件致病性真菌［1］，其细胞壁的结构似三明治-内层为葡聚糖(glucan)，外层为甘露聚糖，其中葡聚糖和甘露糖蛋白至少占细胞壁干重的80%［2］，β-葡聚糖是白色念珠菌细胞壁含量最高的多糖。

本研究前期实验已经成功地从白色念珠菌细胞壁中提取出碱溶性β-葡聚糖(CABBG)、酸溶性β-葡聚糖(CAABG)，并分离出不溶性的β-葡聚糖［3］(CAIBG)，且急性毒性实验研究结果显示CAIBG比CAABG、CABBG的安全范围更大，最值得进一步研究其药效学作用。

本研究自制CAIBG，体外培养B16恶性黑色素瘤细胞、SGC-7901胃腺癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞，观察并结合MTT法检测CAIBG对以上几种肿瘤细胞生长的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 瘤细胞株 SGC-7901胃腺癌株、SMMC-7721肝癌株，由云南省天然药物药理重点实验室提供;B16恶性黑色素瘤株从中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库处购买。

1.2 菌株 白色念珠菌-CJ(Candida albicans-CJ)，云南省天然药物药理重点实验室保存菌株。

1.3 药品与主要试剂 噻唑蓝(MTT)为德州德药制药有限公司产品;a-淀粉酶为上海博奥生物技术有限公司产品;RPMI1640为GIBO公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物公司产品。

1.4 主要仪器 发酵罐(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC，型号BIOFLO-410);CO2培养箱(日本 Olympus公司，型号BH2);酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司，型号680)。

1.5 白色念珠菌的培养 按方法［4］共收集3000 g白色念珠菌菌体。

1.6 CAIBG的提取 按方法［5］获得干燥粉末100 mg，放入4℃保存备用。

1.7 自制CAIBG剂型及给药浓度 用电子天平准确称取CAIBG粉末，溶于1%吐温-80溶液中，0.2 μm微孔滤膜过滤后，即配制成不同浓度的溶液。

1.8 采用改良MTT法检测CAIBG对癌细胞的体外抑制作用:常规培养B16恶性黑色素瘤细胞、SGC-7901胃腺癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培养基调整细胞以1×104细胞/孔的密度分别接种于3个96孔板，每孔加细胞悬液90μl，每个浓度设5个复孔，在37℃，100%相对湿度，含5%CO2的培养箱预培养24 h。待细胞贴壁后，分别加入500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5 μg/ml、31.25 μg/ml 的多糖溶液、阴性对照剂生理盐水和溶剂对照剂吐温80各10μl。分别置37℃、CO2培养箱培养24 h、48 h、72 h 后，加入MTT(5 mg/mL)10 μl继续培养，4 h 后加入三联液 100 μl，过夜，次晨在570 nm波长处用酶标仪测吸光度(A570)值。试验重复三次，计算各组均值。根据以下公式计算出癌细胞生长抑制率:

癌细胞生长抑制率%=(1-实验组平均A570值/对照组平均A570值)×100%

数据处理通常以T/C表示，T/C=100×OD值处理组/OD值对照组。通过回归计算，求出T/C=50%的药物浓度，即IC50值(半数抑制浓度)

1.9 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行多组间及组内差异χ2检验，各组实验的结果用抑癌率表示。

2 结果

2.1 CAIBG作用后肿瘤细胞的形态学变化(见图1-图4)，镜下观察:对照组细胞排列密集，细胞呈圆形，大小不一，核分裂相及瘤巨细胞多见。而加有CAIBG的B16恶性黑色素瘤细胞和SCG-7901胃癌细胞，排列稀疏，核分裂相减少，细胞呈多形性改变。CAIBG组和阴性对照组比较，SMMC-7721肝癌细胞形态没有明显变化。①B16恶性黑色素瘤细胞;②SCG-7901胃癌细胞。

图1 阴性对照组48 h

图2 CAIBG(500 μg/ml)48 h

图3 阴性对照组48 h

图4 CAIBG(31.25 μg/ml)48 h

2.2 CAIBG对体外培养B16恶性黑色素瘤细胞的生长抑制作用。

表1 CAIBG对体外培养B16恶性黑色素瘤细胞的生长抑制作用

CAIBG对体外培养的B16恶性黑色素瘤细胞增殖有抑制作用，与阴性组比较均有显著差异(P＜0.01)。在CAIBG浓度达到 500μg/ml时抑制作用最强，抑制率最高达到42.8%;用软件计算出CAIBG作用于B16恶性黑色素瘤细胞系的半数抑制浓度(IC50)约为1.51 mg/ml。在各浓度作用点上，CAIBG对肿瘤细胞的抑制作用随时间延长而趋于明显(P＜0.05)。在相同时间点上，CAIBG对B16恶性黑色素瘤细胞的抑制作用随浓度增加而增强。

2.3 CAIBG对体外培养胃癌SCG-7901细胞的生长抑制作用

表2 CAIBG对体外培养胃癌SCG-7901细胞的生长抑制作用

在CAIBG浓度达到31.25 μg/ml时抑制作用最强，抑制率最高达到59.88%;用软件计算出CAIBG作用于SCG-7901胃癌细胞系的半数抑制浓度(IC50)约为0.43 mg/ml。在各浓度作用点上，CAIBG对肿瘤细胞的抑制作用随时间延长而趋于明显(P＜0.05)。在相同时间点上，CAIBG对SCG-7901胃癌细胞的抑制作用随浓度增加而减弱。

3 讨论

白色念珠菌作为一种条件致病真菌，关于它的研究一直以来大多是针对其预防，诊断和治疗，研究其细胞壁多糖的在国内外都不多见。以往研究证实不溶性β-葡聚糖具有免疫学活性［5，6］。

本研究为了探讨CAIBG的体外抗肿瘤作用，用MTT法检测各癌细胞株加入不同剂量CAIBG后的生长抑制率。结果证明，在没有添加任何附加条件的前提下，受CAIBG作用的B16恶性黑色素瘤细胞和SGC-7901胃腺癌细胞，细胞排列稀疏，核分裂相减少，细胞呈多形性改变，与对照组比较细胞增生不活跃，形态学上证实了CAIBG具有体外直接抗肿瘤细胞增殖的作用。

不溶性的β-葡聚糖呈颗粒状，易与受体结合，能激活相应的信号传导途径［7］。本实验中，不能排除CAIBG直接与肿瘤细胞膜表面的受体结合，从而发挥体外直接抑制肿瘤细胞生长的可能性。许多研究证实了CR3是β-葡聚糖抗肿瘤受体基础之一。属于β-葡聚糖受体的CR3有两个不同配体结合区域:I域作为iC3b的结合部位，与其结合，介导白细胞与NK细胞对iC3b调理的微生物或靶细胞的细胞毒功能;凝集素部位与β-葡聚糖特异性结合，激活巨噬细胞，继而触发对iC3b调理的肿瘤细胞的细胞毒反应［8］。Yan等［9］从 CR3受体水平对酵母β-葡聚糖抗肿瘤作用的研究揭示了β-葡聚糖通过作用于CR3受体介导的抗肿瘤效应，β-葡聚糖与CR3的凝集素结合部位结合后使巨噬细胞，NK细胞，中性粒细胞处于预激活状态，通过iC3b作为枢纽，使效应细胞和靶细胞结合在一起，从而杀伤靶细胞，发挥细胞毒作用。

综上所述，CAIBG可能通过与肿瘤细胞膜上的受体结合，改变肿瘤细胞的能量转化或影响其细胞通道的开放而导致细胞代谢障碍，达到直接抑制肿瘤细胞生长的作用。值得进一步研究和探讨CAIBG的体内抗肿瘤作用及其机制，以及与化疗药物联合应用的协同作用，具有广阔的前景。

［1］陆德源.医学微生物学.人民卫生出版社，1993:237.

［2］Yadomae T，Ohno N.Structure activity relationship of immunomodulating(1 →3)-β-D glucans.Recent Research Development in Chem＆PharmSciences，1996，5(1):23-33.

［3］袁玲玲，崔进，汤显斌，等.白念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖升高小鼠血清IL-1β、TNF-α的研究.现代免疫学，2007，27(5):378-381.

［4］Ishitani K，Suzuki S，Suzuki M.Antitumor activity of polygalactosamine isolated from Paecilomyces sp.I-1 strain.Pharmacobiodyn，1988，11(1):58-65.

［5］Gopal PK，Sullivan PA，ShepHerd MG.Analysis of wall glucans from yeast，hyphal and germ-tube forming cells of Candida albicans.Gen Microbiol，1984，130(12):3295-301.

［6］Abel G，Czop JK，Stimulation of human monocyteβ-glucans receptors by glucan particles induces production of TNF-α and IL-1β.Int Immunopharmacol，1991，14:1363-1373.

［6］陈传红.真菌多糖药理作用研究进展.时珍国医国药，2006，17(6):933-934.

［7］LI Min，Chen Qing，Sun Jun-jiang，et al.The effect ofβ-glucan of cell wall from Candida albicans on interleukin-6and interleukin-8production by human peripheral blood mononuclear cells in vitro.J Clin Dermatol，2002，31(6):349-350.

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［9］Yan J，Vetvicka，Xia Y，et al.β-Glucan，a"Specific"Biologic Response Modifier That Uses Antibodies to Target Tumors for Cytotoxic Recognition by Leukocyte Complement Receptor Type 3(CD11b/CD18). The JoumalofInmunology， 1999，163:3045-3052.