高效液相色谱法测定固经丸中黄芩苷含量

张 捷，张艳萍，王 欢，刘昌叶，谭生建

（1.中国人民解放军第306医院药学部，北京 100101； 2.中国人民解放军白求恩军医学院药学系，河北 石家庄 050000）

固经丸由黄柏、黄芩、白芍、香附等6味药材细粉用水泛丸制成，具有滋阴清热、固经止带功能，用于治疗阴虚血热，月经先期，经血量多、色紫黑，赤白带下[1]。黄芩苷为固经丸中清热、抗炎的活性成分。2005年版《中国药典（一部）》中收载了固经丸的性状、鉴别、检查等项目，但无含量测定方法；黄芩及其制剂中的黄芩苷含量测定报道有高效液相色谱（HPLC）法[1-3]。目前，固经丸中黄芩苷的含量测定方法尚未见报道。为此，本试验建立了测定固经丸中黄芩苷含量的HPLC法，报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括2800液相色谱泵、7215型手动进样器、BIO-Dimension紫外可见分光光度检测器（美国BIO-RAD公司）；TL-9900型色谱数据工作站（北京泰乐公司）。黄芩苷对照品（批号为0715-9708，中国药品生物制品检定所）；试验用药材经本院药检室鉴别均符合2005年版《中国药典（一部）》规定；试验用固经丸及阴性样品（本院制剂室制备）；乙腈（天津市西华特种试剂厂，批号为20041018）为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Intersil C18分析色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），C18保护柱（北京分析仪器厂，5 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -水（26 ∶74，含 5 mL 三乙胺，以磷酸调 pH=2.6）；流速：1.0 mL/min；检测波长：276 nm；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，取 2.2项下3种溶液，分别进样并记录色谱图（图1）。可见，黄芩苷保留时间约为13.5 min，与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数为2 950。

2.2 溶液制备

取黄芩苷对照品20.2 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（每1 mL含黄芩苷202.0 μg）。取固经丸12 g，研细，取细粉0.38 g（相当于黄芩0.05 g），精密称定，置25 mL量瓶中，精密加70%乙醇25 mL，精密称定，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）40 min，放冷，精密称定，补足减失的溶剂，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄芩阴性样品0.38 g，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液（202.0 μg/mL）1，5，10，20，25 mL，置 50 mL 量瓶中，加 70%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别取各稀释液注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以峰面积 Y对进样质量浓度 X进行线性回归，回归方程为 Y=796 121.5 X+621 926.0，r=0.999 9（n=5）。结果表明，黄芩苷质量浓度线性范围是 20.20 ～ 202.00 μg/mL。

精密度试验：取对照品溶液（101.0 μg/mL），重复进样5次。结果峰面积的 RSD=1.6%（n=5），表明仪器精密度良好。

重现性试验：取样品10 g，研细，依法制备供试品溶液并测定含量。结果黄芩苷含量的 RSD=1.7%（n=6），表明方法重现性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，于0，1，2，4，6 h时依法进样，记录色谱峰面积。结果峰面积的 RSD=1.3%（n=5），表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20050304-1）10 g，研细，取细粉0.19 g，精密称定，置25 mL量瓶中，精密加入对照品贮备液12.5 mL，加70%乙醇12.5 mL，精密称定，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定黄芩苷的含量，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录黄芩苷色谱峰面积，外标法以峰面积计算含量。结果批号为20050304-1，20050304-2，20050304-3的3批样品中黄芩苷含量分别为1.2%，1.1%，1.2%。

3 讨论

经紫外光谱扫描发现，黄芩苷在276 nm波长处有最大吸收，因此选择276 nm作为测定波长。对2005年版《中国药典（一部）》黄芩项下含量测定采用的流动相和本试验中的流动相进行了对比，结果显示，以黄芩苷色谱峰计算，药典方法的流动相理论塔板数在1 900～2 000，本试验中流动相的理论塔板数在2 900～3 000，表明本试验中的流动相的适用性较好。参考2005年版《中国药典（一部）》黄芩项下含量测定方法，以70%乙醇为溶剂，分别试验了超声提取30，40，50 min的提取效果，以超声50 min的提取率为100%计算，超声30 min和40 min的提取率分别为99.9%和101.2%，故确定超声提取时间为40 min。

本方法操作简便，测定结果准确可靠，可用于固经丸中黄芩苷的含量测定。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005:211.

[2]杨立新，列 岱，冯学锋，等.高效液相色谱法测定不同产地黄芩中黄酮化合物的含量[J]. 中国中药杂志，2002，27（3）：166-168.

[3]杨 帆，李 攀，邓开英.高效液相色谱法测定小儿牛黄清肺丸中黄芩苷含量[J]. 中国药业，2008，17（18）：32-33.