猪圆环病毒2型甘肃株全基因组克隆及序列分析*

贾怀杰,王晓霞,房永祥,陈国华,李玩生,窦永喜,李克斌,2,瞿惠玲,2,3,景志忠*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点实验室,甘肃兰州 730046;2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;3.甘肃省兽医局,甘肃兰州 730030)

猪圆环病毒2型甘肃株全基因组克隆及序列分析*

贾怀杰1,王晓霞1,房永祥1,陈国华1,李玩生1,窦永喜1,李克斌1,2,瞿惠玲1,2,3,景志忠1*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点实验室,甘肃兰州 730046;2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;3.甘肃省兽医局,甘肃兰州 730030)

参照GenBank中登录的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列,设计合成了两对特异性引物,从甘肃白银疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取病毒DNA,分步扩增全基因组。回收PCR产物,将其插入pGEM-T Easy载体,构建了重组质粒pGEM-PCV-2,转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。结果表明,克隆到的PCV-2全基因组长度为1 767 bp。应用DNA Star序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中登录的包括甘肃在内的国内外PCV毒株进行同源性分析。结果显示,克隆的PCV-2与英国株(UK-EU656143)遗传关系最近,其核苷酸和推导的氨基酸序列同源性高达96.2%和91.0%,与已报道的2株甘肃毒株(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482)遗传关系较远,可能是流行于甘肃白银的一个变异毒株(GSBY)。

猪圆环病毒2型;基因组;克隆;序列分析

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等的主要病原。自1991年PMWS在北美洲最先发现以来,已在世界范围内流行[1]。郎洪武等[2]首次报道中国猪群存在PCV-2感染,感染率为42.9%。周绪斌等[3]报道,我国在2000年-2005年期间20多个省市PCV-2感染平均阳性率达55.0%。由于PCV-2主要侵害机体的免疫系统,导致感染猪免疫抑制,易继发感染其他病毒和细菌[4-6],能引起多种疾病,防控难度加大。PMWS既可水平传播,导致断奶仔猪发病死亡,亦可垂直传播,引起繁殖障碍[5],仔猪死亡率明显升高,对中国的养猪业造成巨大的经济损失,成为目前中国养猪业重要传染病之一。

在我国养猪生产实践中,PCV-2的混合感染和持续性感染非常普遍,仅仅依赖单一疫苗防控显然是不够的,因此,需对该病进行系统研究和重新认识。本试验采用PCR分步扩增技术,从疑似 PMWS病料中克隆PCV-2的全基因组,分析地方毒株间的差异,探讨PCV-2毒株间的基因组序列的变异规律,从而为研究其生物学特性、流行病学、致病机理等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来自甘肃白银某猪场疑似PMWS病死猪的组织(包括肺、淋巴结、肝和肾)。pGEM-T Easy Vector购自Promega公司,病毒DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂盒(包括TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer)、限制性内切酶EcoRⅠ、DNA Marker DL 2 000均购自宝生物工程(大连)有限公司;氨苄青霉素(Amp)购自Amresco公司。宿主菌大肠埃希菌DH5α由农业部兽医公共卫生重点实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自博大泰恒公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参照GenBank发表的PCV-2全基因序列,利用Oligo6.0生物软件设计2对引物分A、B两段进行扩增。预期扩增大小分别为1 141 bp和1 169 bp的A、B片段。其序列如下:

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并经PAGE电泳纯化,使用前用灭菌三蒸水溶解 ,浓度为 25 μ mol/L,置-20 ℃保存。

1.2.2 模板的制备 将所采病料加入石英砂充分研磨,反复冻融3次,5 000 r/min离心5 min,取0.25 mL上清,按照宝生物工程(大连)有限公司病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA。取适量用作PCR模板。

1.2.3 PCV-2全基因片段的PCR扩增

1.2.3.1 A、B片段的PCR扩增 建立50 μ L PCR反应体系 ,DNA 模板 3 μ L,10 ×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 4 μ L,25 μ mol/L上下游引物各1 μ L,TaqDNA 聚合酶0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L 。PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃1 min,58℃1 min,72℃1.5 min,共 35个循环;最后72℃延伸10 min。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。B片段PCR扩增:建立50 μ L PCR反应体系,DNA 模 板 3 μ L,10 ×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNT Ps 4 μ L,25 μ mol/L 上 下游引物各 1 μ L,TaqDNA 聚 合 酶 0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L。PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94℃1 min,55℃1 min,72℃1.5 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应结束后,各取5 μ L PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测。建立50 μ L PCR 反应体系,分别扩增 A、B 片段:DNA 模 板 3 μ L,10 × PCR buffer5 μ L,2.5 mmol/L dNT Ps 4 μ L,25 μ mol/L 上 下游引物各 1 μ L,TaqDNA 聚 合 酶 0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L。PCR反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃1.5 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

1.2.3.2 A、B片段PCR产物的回收 PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,按说明书操作,电泳鉴定回收的PCR产物。

1.2.3.3 全基因组片段的PCR扩增 以回收的A、B片段PCR产物为模板、A1和 B2为上、下游引物扩增PCV-2全基因组。建立50 μ L PCR反应体系,A、B片段 PCR 产物各 1 μ L,10×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 4 μ L,TaqDNA 聚合酶0.5 μ L,最后加水至49 μ L。反应条件为:94 ℃预变性5 min;94℃1 min,56.7℃1 min,72℃2 min,1个循环,停止 PCR仪运行,补加 A1和 B2各0.5 μ L,94 ℃1 min,56.7 ℃1 min,72 ℃2 min,再运行34个循环;最后72℃后延伸30 min。反应结束后,各取5 μ L PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.4 PCR产物的连接及转化 按分子克隆操作把回收的目的基因片段和pGEM-T Easy载体连接。连接体系 :2×Rapid Ligation buffer 5.0 μ L,目的片 段 2 μ L,pGEM-T Vector 1.0 μ L,T4 DNA Ligase 1.0 μ L,补加去离子水至终体积 10 μ L 。连接产物于 4℃连接过夜、转化感受态大肠埃希菌DH5α,并涂布于含氨苄(50 mg/L)的琼脂LB平板上,37℃恒温培养12 h～16 h。菌落经PCR鉴定后,挑取单个阳性菌落接种于含氨苄(50 mg/L)的液体LB培养基中,振荡培养,按照博大泰恒公司质粒提取试剂盒提取质粒,PCR和EcoRⅠ酶切鉴定。

1.2.5 阳性重组质粒的筛选及鉴定 随机挑取上述转化平皿中的白色单菌落,接种到含氨苄的 LB液体培养基中,37℃振荡过夜培养,至培养液呈云雾状,对菌液提取质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定,筛选阳性克隆。

1.2.6 序列分析 将阳性重组质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序,并与GenBank中登录的国内外毒株进行序列的同源性比较。

2 结果

2.1 PCV-2全基因片段的PCR扩增

2.1.1 PCV-2 A、B片段的 PCR扩增 以疑似PMWS病死猪的组织提取病毒的DNA,以此DNA为膜板,以A1和A2,B1和B2为引物分别进行A和B片段的 PCR扩增,结果扩增出了大小约1 100 bp的两个片段,与预期结果相符(图1)。

2.1.2 PCV-2全基因片段的PCR扩增 以回收的A、B片段PCR产物为模板,A1、B2为上、下游引物扩增PCV-2全基因组,扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,结果扩增出了1 800 bp左右的特异性片段,暂定为PCV-2甘肃白银株(PCV-2-GSBY)基因组序列,与预期片段大小相符(图2)。

2.2 全基因组的克隆与鉴定

将扩增纯化产物与pGEM-T Easy载体连接后,转化到大肠埃希菌DH5α,经过PCR、酶切快速鉴定和测序结果表明,克隆的阳性重组质粒均带有相应的目的片段(图3和图4)。

图1 PCV-2 A、B片段的PCR扩增Fig.1 Amplification of A and B fragments of PCV-2 by PCR

图2 PCV-2全基因组的PCR扩增Fig.2 Amplification of PCV-2 genome by PCR

图3 重组质粒pGEM-PCV-2 PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pGEM-PCV-2 by PCR

图4 重组质粒pGEM-PCV-2的酶切鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pGEM-PCV-2 by digestion

2.3 测序和序列比较

将经PCR和酶切鉴定阳性的重组质粒进行测序。所得病毒基因组序列长度为1 767 bp,与预期结果相符。用DNA Star软件将所克隆的PCV-2 GSBY的全基因组核苷酸序列、ORF1的氨基酸和ORF2的氨基酸与GenBank的代表毒株核苷酸及氨基酸进行比对,并绘制其进化树。PCV-2毒株间的核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性比较,结果显示,所有 PCV-2毒株间同源性均很高,分别为95.3%～99.7%、62.4%～99.5%,本研究所克隆的PCV-2 GSBY毒株的核苷酸及其推导的氨基酸序列与其他毒株的同源性在95.3%～96.2%、62.4%～91.0%之间。

将编码PCV-2主要蛋白(Rep蛋白和Cap蛋白)的2个阅读框(ORF1与ORF2)进行了氨基酸序列的变异分析。结果显示,ORF1编码的Rep蛋白的氨基酸序列同源性为95.2%～100%;ORF2编码Cap蛋白的氨基酸同源性为79.1%～100%,说明不同PCV-2毒株之间ORF1比较稳定,ORF2相对差异较大。本研究分离克隆的PCV-2 GSBY的Rep、Cap蛋白与其他毒株的氨基酸序列比较,同源性分别为95.2%～96.2%和79.1%～88.0%(表1)。

表1 PCV-2毒株核苷酸、Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸同源性比较Table 1 Homological comparison of the nucleotide,Rep protein,Cap protein of PCV-2 strains

表1中对应的GenBank登录号如下:甘肃兰州株(GSLZ-FJ447482),甘肃株(GS03-EU547458),台湾株(Taiwan-AF166528),加拿大株(Canada-AF408635),美国株(USA-AJ223185),法国株(France-AY321987),英国株(UK-EU656143),山东株(Shandong-DQ346683),丹麦株(Denmark-EF565349),河南株(Zhoukou-EU656143)。

为了更好地了解PCV-2 GSBY毒株的分类地位及其遗传演化关系,在分析PCV毒株同源性的基础上与GenBank的16株PCV-2和2株PCV-1代表毒株核苷酸遗传进化分析,并绘制了其系统发生进化树(图6)。从图中可以看出,PCV-1和PCV-2两个基因型间差异较大,明显分为两支。PCV-2各个分离毒株间在进化上存在着某些地理位置上的相关性,分为两大主群。一群以北美洲地区分离毒株为主,主要有加拿大株和美国株。另一群以欧洲地区分离毒株为主,主要有英国株、法国株和丹麦株等,还有部分中国分离毒株。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株与英国株同源性较高,被分在同一主支上,在此主支中又由两个分支组成。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株与已报道的GS03(EU547458)、GSLZ(FJ447482)和山东(DQ346683)等其他国内分离(流行)毒株关系较远,被分在两个不同的小分支上,而后处于一个小的分支。

图5 PCV进化树分析图Fig.5 Phylogenetic tree of PCV

2.4 PCV-2 GSBY株ORF2基因编码的氨基酸抗原性和亲水性分析

测序结果表明PCV-2 GSBY株ORF2基因长702 bp,编码230个氨基酸,其推导的氨基酸序列如下所示:LRVKWGVFKIKFSELYIHGYTDIVVLVVYTVFERSAEAYMVYISSSLSQPELISFVIGLEVIDCPIKDRFGGEIAGVVGEGLGYGMAGGVVYIGVIG.GISLCYKVIINNSSGAHSPVT LGDWGAGPESNLNLPYSVVFKGHSEGVAPSWGKKIINIKSHHVHIPGGRSYCGSFDSITDGAGEAGVEDAIFPSPAVTVAGVDEPGAAAEDLAKMAAGAVSSSSVTPPWIRH。分子质量大约为 24 ku。该蛋白含有15个碱性氨基酸(K,R),且有多处串联的碱性氨基酸(R);22个酸性氨基酸(D,E);91个亲水性氨基酸(A,I,L,F,W,V);45个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。

利用DNA Star软件对Cap蛋白的抗原表位预测,ORF2编码的氨基酸在第68位～73位、113位～116位 、129位 ～133位、143 位～148位、169位～174位、181位～184位和205位～209位可能存在抗原表位(图6)。对ORF2编码蛋白的亲水性分析表明,该蛋白具有较强的亲水性(图7)。

图6 GSBY株ORF2多肽抗原表位分析Fig.6 Antigenicity of ORF2 protein of GSBY

图7 GSBY株ORF2多肽亲水性分析Fig.7 Hydrophilicity of ORF2 protein of GSBY

3 讨论

PCV-2被认为是PMWS、猪皮炎-肾炎综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、先天性震颤(CT)等疾病的主要病原。该病毒引起的疾病在世界范围内广泛流行,给养猪业造成了的巨大经济损失,己引起各国高度重视。

猪圆环病毒(PCV)有2种基因型,即PCV-1和PCV-2,其中 PCV-1全基因组大小为 1 759 bp,PCV-2全基因组大小有1 767 bp或1 768 bp 2种。PCV-2有11个开放阅读框(ORFs),研究较多的是ORF1和ORF2,其中对ORF2的研究已成为热点。PCV-2的ORF编码Rep蛋白的有945个碱基,编码314个氨基酸,有3个糖基化位点,其编码蛋白与PCV的复制相关,与PCV-1的ORF1编码蛋白有相同的抗原性。ORF2编码的Cap蛋白是PCV-2的核衣壳蛋白,具有很好的免疫原性,是构建重组疫苗和检测病原的首选基因[7-8]。Mahe等用杆状病毒和质粒载体表达了ORF1和ORF2,发现PCV-1 ORF2虽与PCV-2 ORF2的抗原性相关,但只有ORF2蛋白可以被PCV-2多抗识别。Liu Q等[8]将ORF2基因连接到MBP-His(8)-tag基因3′端,在细菌中表达了ORF2融合蛋白,该融合蛋白可以与PCV-2的多抗反应。这一结果表明,可以用ORF2来区分PCV-1和PCV-2。

虽然PCV在进化上比较保守,但是引起的临床疾病却广泛多样,而且病毒基因会随着时间的推移逐渐发生变异。据报道,病毒在连传120代的过程中发生了碱基突变,使得病毒的复制能力提高[9-10]。而且,病毒随着时间的流逝也逐渐发生了变异,这些变异是否导致毒力发生变化,至今为止,还未能证明当前不同国家和不同临床病症下分离到的PCV-2毒株间的致病性有何差异。目前,虽然PCV的研究己取得了很大的进展,但病毒是从何而来的,是如何传入家猪群的,又是如何演变的,尚不十分明了。因此,对PCV-2毒株基因组序列差异的研究,有助于阐明疫病暴发的真正原因。

本研究克隆的甘肃白银流行毒株(PCV-2 GSBY)基因组大小为1 767 bp,与其他PCV-2毒株全基因组核苷酸序列同源性在95.7%～96.2%之间,而与PCV-1核苷酸同源性仅为77.4%～83.6%,说明PCV-2 GSBY与所有PCV-2毒株间有较近的遗传演化关系,与PCV-1间关系较远。已有研究证实,尽管PCV-2基因组比较保守,但也存在着变异,变异的发生与地理分布有某种程度上的相关性。从遗传进化树上可以看出,目前全球圆环病毒2型主要有两大群,即以英国毒株为主的欧洲群和以美国和加拿大毒株为主的美洲群,而这两大洲是发生猪圆环病毒病较早的地区。另外,还可看出国内毒株与欧洲株遗传关系较近。根据流行病学的情况,该病在亚洲地区是近些年发生的,这提示我们,我国猪圆环病毒病的发生可能与在不同地区、不同时间引种有关。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株与英国株(UK-EU656143)关系最为密切,而与已报道的两株甘肃毒株(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482)关系较远,说明该毒株可能是流行于甘肃的一个变异毒株,这些研究结果将为甘肃PCV的流行病学和疫病防控提供科学依据。

本研究从甘肃省白银市某猪场采集疑似PMWS症状的病料,采用PCR检测方法对 PCV-2进行DNA病原检测,对其阳性病料的PCV-2进行全基因组扩增、克隆和测序,分析甘肃白银流行株基因组、ORF2编码Cap蛋白与国内外分离株间的遗传演化关系以及抗原性,补充了 PCV-2流行病学资料,为我国深入研究和防控该病奠定了基础。

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Cloning and Sequence Analysis of the Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 Gansu Isolate

JIA Huai-jie1,WANG Xiao-xia1,FANG Yong-xiang1,CHEN Guo-hua1,LI Wan-sheng1,DOU Yong-xi1,LI Ke-bin1,2,QU Hui-ling1,2,3,JING Zhi-zhong1

(1.State K ey Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture,Lanzhou Veterinary Research Institute,CAAS,Lanzhou,Gansu,730046,China;2.Veterinary College of Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu,730070,China;3.Veterinary Bureau of Gansu Province,Lanzhou,Gansu,730030,China)

Two pairs of primers were designied and synthesized according to the full length genome of PCV-2 in GenBank.Virus DNA was extracted from samples of suspected postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)pig in Baiyin,Gansu province,and the full length genome of PCV-2 was cloned into pGEM-T easy vector,recombinant vector pGEM PCV-2 was constructed and then sequenced.Sequence analysis with DNA Star software showed that the genome of PCV-2 Gansu Baiyin isolate(GSBY)is 1 767 bp,the results of homology comparison of the full length genome among isolates published in GenBank indicated that GSBY isolate displayed high nucleotide and amino acid identities with England(UKEU656143)isolate(96.2%nucleotide identity and 91.0%amino acid identity),but was different from other two Gansu epidemic isolates(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482).So GSBY isolate in this test may be a variant isolate prevalent in Baiyin,Gansu.

Porcine circovirus type 2;genome;cloning;sequence analysis

Q78;S852.659.2

A

1007-5038(2010)02-0001-06

2009-05-26

国家自然基金项目(30871884);国家支撑计划(2006BAD31B03)和甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)

贾怀杰(1980-),男,甘肃临夏人,研究实习员,硕士,主要从事人兽共患病及病原与宿主分子生物学与免疫学研究。*通讯作者