鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立*

詹爱军,王新卫,陈书琨,孙 洁,陈 兵,阮周曦,花群义*

(1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳 518010;2.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州 450002)

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立*

詹爱军1,王新卫2,陈书琨1,孙 洁1,陈 兵1,阮周曦1,花群义1*

(1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳 518010;2.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州 450002)

为建立可检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速检测技术,用DNA Star软件对GenBank中EHDV的VP7基因进行序列分析,设计EHDV特异性探针并用生物素标记,与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立了EHDV快速高通量液相芯片检测方法。检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度为100个 TCID50。建立了快速检测EHDV的液相芯片技术,为进一步搭建EHDV快速高通量检测平台奠定了基础。

流行性出血病病毒;液相芯片;检测

鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)引起的,以白尾鹿体温升高、黏膜和浆膜面广泛出血并常处于昏迷状态下死亡为特征的严重致死性虫媒病[1]。EHDV于1955年首次在美国新泽西州的白尾鹿中分离到,随后加拿大、日本、南非、澳大利亚和尼日利亚都分离到EHDV[2]。由于此病危害较大,严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展,我国已将EHD列为二类传染病,但国内对此病研究较少[2-3]。虽然我国目前还没有EHD发生,但是由于EHDV已存在于周边国家(如日本、朝鲜)[4],有传入我国的风险,因此应加强监测。

液相芯片检测技术是一个全新的快速高通量检测技术,该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体[5-10],具有独特的优点,通过高通量手段可降低成本和劳动力;检测样本量需求少,可通过液相荧光编码微球芯片的方法,在自然的液相反应条件下缩短检测时间;相对于固相平板芯片,液相反应动力学反应更快速,重复性更好;1种～100种灵活多重检测,满足多种检测需求,开发平台可适用于多种检测试剂和软件的开发。此外,该方法避免了RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)等常规方法的不能满足出入境高通量检疫的缺点[11-12]。鉴于此,笔者依据实际需要,采用PCR检测方法与液相芯片检测技术结合,初步建立EHDV液相芯片快速检测方法,为快速、高通量检测EHD提供了技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和试剂 带有蓝舌病病毒(BTV)的VP7基因的质粒PMT-BTV-VP7、水疱性口炎病毒(VSV)的NP基因质粒 PM T-VSV-NP、EHDV的VP7基因质粒 PMT-EHDV-VP7、阿卡斑病毒(AKV)的N基因质粒PMT-AKV-N和西尼罗病毒(EHDV)的E基因质粒PM T-EHDV-E由深圳出入境检验检疫局动植物中心动检实验室(下为本室)构建,带有质粒的菌株由本室保存。EHDV由本室保存,所有样品为进口冻品。

Mini BEST Plasmid Purification Kit(2.0)、PCR Amplification Kit和DNA Fragment purification kit(2.0)为宝生物工程(大连)有限公司产品,Qiagen Viral RNA Mini Kit、Qiagen OneStep RTPCR Kit与EZ1 Virus mini Kit2.0为 Qiagen公司产品;EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodimide hydrochloride)为 Pierce公司产品;Streptavidin R-Phycoerythrin Lumi Grade为Roche Applied Science公司产品;0.5 mol/L MES(2-[NMorpholino]ethanesulfonic acid hydrate)Solution为 Fluka公司产品 ;Tween 20、SDS 、100 mL/L so-lution 、Sarkosyl、TE(T ris-EDTA)buffer(pH 8.0,100×)、5 mol/L TMAC(Tetramethylammonium chloride solution)、1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)与Sodium ChlorideTriton X-100为Sigma公司产品,所用各种表面含有羧基的荧光编码微球来自Luminex和Qiagen公司。

1.1.2 主要仪器设备 小型全自动核酸抽提工作站,高速台式冷冻离心机,梯度核酸扩增仪,梯度核酸扩增仪,液相芯片检测工作站,凝胶成像分析仪。

1.2 方法

1.2.1 引物与探针的设计与合成 选取不同国家和地区的GenBank上EHDV的VP7基因序列,进行序列在线分析后利用DNA Star(V.5.0)分析,找出基因中最保守的25个寡核苷酸(oligo nucleotide,nt)作为液相芯片检测探针,探针Tm值在60℃～62℃,在其5′端标记-NH2。分别在探针的上下游设计特异性的扩增引物。同时根据探针的序列设计其反向互补序列作为建立反应体系的阳性对照。探针及反向互补序列、引物的序列如下:EHD VP7,206 bp(387 ～ 592),Tm=79 ℃,P1:5′-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3′;P2:5′-CCGCTGCAT TCGAAAAAGTC-3′;Probe:5′-ATCGTATCCTCGACTT TAGCTCAGG-3′;RC-Probe:5′-CCTGAGCTAAAGTCGAGGATACGAT-3′。引物、探针送Sigma公司合成,下游引物的5′端标记生物素,Probe的5′-C6标记氨基,探针反向互补序列RC-Probe的5′端标记生物素。引物用水溶解成200 μ mol/L贮存母液备用。

1.2.2 PCR扩增体系的建立 用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提带有EHDV的VP7基因质粒PMT-EHDV-VP7,按照PCR Amplification Kit Handbook推荐的方法建立 EHDV VP7基因通用PCR检测方法,同时以鲑鱼精子蛋白基因DNA片段做为阴性对照。PCR的反应体系如下(50 μ L):RNase-free H2O 31 μ L;10 × Qiagen onestep RT-PCR buffer10 μ L;dNTP mix(10 mmol/L/each)4 μ L;Taq(5 U/μ L)2 μ L;primer*P1(20 μ mol/L ～ 80 μ mol/L)1 μ L;template(Plasmid DNA)2 μ L;primer*P2(20 μ mol/L～ 80 μ mol/L)2 μ L。反应程序:95 ℃ 3 min;94 ℃30 s,52℃1 min 30 s,72℃1 min,15个循环;72℃延伸10 min。用Qiagen Viral RNA Mini Kit抽提EHDV RNA,同样按照 Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook推荐的方法建立50 μ L EHDV基因通用 RT-PCR检测方法。反应结束后,取5 μ L RTPCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.3 EHDV核酸液相芯片(PLex)检测体系的建立

1.2.3.1 EDC一步法偶联寡核苷酸探针与Luminex羧基化的荧光编码微球 按照Luminex推荐的荧光编码微球序号,与EHDV的VP7基因的特异性寡核苷酸探针一一对应进行偶联,荧光编码微球与探针的偶联参照Luminex推荐操作步骤进行[13-14]。偶联后与其RC-Probe进行杂交反应,并设空白对照,以确定偶联是否有效。根据Luminex公司推荐的判定标准,当每种荧光编码微球个数不少于20个且背景空白荧光强度不高于500,表明试验成立,进行结果判定。

1.2.3.2 EHDV液相芯片检测体系的建立 为验证探针偶联的荧光编码微球与与EHDV的VP7基因的PCR产物之间能否正确杂交,取PCR的扩增产物,按照 Luminex推荐的液相芯片步骤,将EHDV基因探针偶联的相应荧光编码微球与扩增产物进行杂交,建立基因偶联探针的荧光编码微球检测体系。设置仪器每次只检测相应编码的荧光编码微球,将上样加热陶瓷底板预先加热至52℃后取样品上机进行检测。结果判定标准同1.2.3.1。

液相芯片定性比值结果(luminex qualitative ratio result,LQRR)等于样品的校正后的荧光强度中位值(median florescence intensity,MFI)与空白对照MFI的平均值(MFIB)的比值,即 LQRR=MFIS/MFIB。如果 LQRR≥3,判定为阳性样本;如果2≤LQRR≤3,则判定为可疑;如果LQRR＜2,则判定为阴性。

1.2.4 PLex快速检测方法灵敏性试验 为确定PLex快速检测方法检测灵敏度,将抽提的 EHDV的VP7基因的质粒DNA进行10倍梯度稀释,连续稀释至10-8;将EHDV的灭活溶液进行10倍梯度稀释,连续稀释至 10-6约 1 TCID50,抽提 RNA,进行RT-PCR扩增。按所建立的方法,确定该方法的灵敏度。

1.2.5 PLex快速检测方法特异性试验 分别取带有BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因、AKV的N基因和EHDV的VP7基因的质粒作为模板,按照1.2.2的方法进行这些基因的PCR扩增,将扩增产物与EHDV基因探针偶联的相应荧光编码微球进行杂交,检测所建方法的特异性。

1.2.6 PLex快速检测方法与RT-PCR比对试验 利用本研究建立的PLex快速检测方法,检测100份实验室保存的进口冻品样品,将所建立的方法与RTPCR方法对比,从而评价其可靠性及临床实用性。

2 结果

2.1 PCR检测方法的建立与优化

PCR在反应体系中其它条件相同的条件下,确定的最佳引物终浓度分别为 0.1 μ mol/L～0.2 μ mol/L,2.5 mmol/L MgCl2的浓度为反应体系中的镁离子浓度。以此条件建立了EHDV PCR检测方法。

2.2 PCR检测结果

带有EHDV VP7基因的质粒PCR检测,可特异性地扩增出所需要的目的条带,约206 bp,与理论结果相符(图1)。

图1 EHDV的PCR和RT-PCR扩增产物电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PCR and RT-PCR products of EHDV

2.3 PLex检测体系的建立

EHDV探针与相应荧光编码的荧光编码微球偶联后,与相应的PCR反应扩增产物直接杂交后显示,各个参与计数的荧光编码微球均≥20个,表明用于计数的荧光编码微球数量有效,所产生的MFI值可信;各个荧光编码微球的空白对照MFI均＜500,表明结果有效,试验可以进行结果判定;PCR扩增产物的MFI明显大于阴性和空白对照的值。探针与相应的PCR扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交,LQRR值都大于10,表明均为阳性(表1)。

2.4 PLex快速检测方法灵敏性试验结果

将抽提的带有EHDV VP7基因的质粒定量后以10倍梯度稀释,进行EHDV VP7基因片段的PCR扩增、纯化后进行PLex快速检测。结果表明(表2),PLex快速检测方法检测EHDV VP7基因的检测灵敏度为10-5,LQRR值约为3.225,通过计算相当于50拷贝;检测病毒稀释液灵敏度为10-4,LQRR值约为3.23,通过计算相当于100 TCID50

2.5 PLex快速检测方法特异性试验结果

对带有BTV的VP7基因、VSV的 NP基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和WNV的E基因的质粒的检测结果显示探针与相应的EHDV的VP7基因PCR扩增的阳性产物之间有特异性的杂交,EHDV的 LQRR值都大于10,表明均为阳性,而与BTV 的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR产物LQRR值都小于2,而空白对照的值很低,低于500(表3),说明建立的PLex检测方法特异性强,方法成立。

2.6 PLex方法与传统方法比对试验结果

对100份实验室保存的进口冻品样品检测结果显示,该法与RT-PCR检测结果完全一致,均为阴性,未出现假阳性。

表 1 EHDV PLex检测MFI值Table 1 M FI value of PLex for EHDV

表2 PLex检测EHDV的灵敏度Table 2 The sensitivity test of PLex for EHDV

表3 PLex检测方法特异性试验结果Table 3 The specificity test of P Lex for EHDV

3 讨论

液相芯片检测技术是一个全新的快速高通量检测技术。该技术中采用的荧光编码微球达100种,可对100种目标同时、准确地检测,PLex快速高通量检测方法的优点主要是能够快速高通量鉴定病毒的存在,通过高通量手段可降低成本和劳动力;检测样本量需求少,可通过液相荧光编码微球芯片的方法,在自然的液相反应条件下缩短检测时间[15-17]。在进行检测时,最佳探针与荧光编码微球偶联的比例需要进行梯度滴定。研究显示,在50 μ L MES偶联体系中,EDC的终浓度越高,偶联效果越好,1.0 mg/mL的浓度偶联效果明显好于0.5 mg/mL。但荧光编码微球的加入量并非越多越好,过多反而影响与探针的偶联效率,导致杂交信号MFI过低。只要探针的浓度相同,与不同量的探针杂交结果相同。探针的长度等也影响检测结果,在研究中发现设计的EHDV VP7基因的探针非常特异,与BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR阳性产物之间无交叉反应,对实验室保存的100份冻存样品检测的结果与RTPCR方法一致,没有出现假阳性。试验中由于没有阳性的病毒样品,所以还无法确定是否会出现假阴性。

本文将PCR方法与Liqui Chip检测方法结合,初步建立了EHDV PLex快速高通量检测方法,搭建了EHDV全新快速高通量检测平台。这为防止该病进入我国提供了技术储备,也为其他同类病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

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Development of Liquichip Detection Technique for Detecting Epizootic Hemorrhagic Disease Virus of Deer

ZHAN Ai-jun1,WANG Xin-wei2,CHEN Shu-kun1,SUN Jie1,CHEN Bing1,RUAN Zhou-xi1,H UA Qun-yi1

(1.Technical Center of Animal and Plant Quarantine Inspection,Shenzhen CIQ,Shenzhen,Guangdong,518010,China;2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou,Henan,450002,China)

To develop liquichip method for detecting epizootic haemorrhagic disease virus of deer,the VP7 gene of EHDV published in the GenBank was analyzed by using the software DNAStar 5.0,and specific EHDV probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres,which was used for hybridization reaction to RT-PCR products of EHDV.Liquichip detection method for detecting EHDV was established by using Liquichip 200 to detect fluorescence signal in the reaction system.The results demonstrated that this detection method showed better specificity to EHDV and no reaction with other insect-borne disease viruses.The sensitivity test indicated that the detecting limit for the EHDV could reach to 100 TCID50.These results suggested that the developed Liquichip detection technique provided a foundation for further research on rapidly high throughput detection for EHDV and also for exploration to detect other viruses with the same way.

Epizootic haemorrhagic disease virus;liquichip;detection

S858.25;S852.65

A

1007-5038(2010)02-0036-05

2009-09-24

科技部“863”计划项目(2006AA10Z445);国家质检总局资助项目(2008IK011)

詹爱军(1970-),男,江苏扬州人,博士后,主要从事分子病毒学和免疫学研究。*通讯作者