红花黄色素对家兔缺血再灌注心肌超微结构和细胞凋亡及bcl-2、bax蛋白表达的影响

徐传金 张文忠 冯培青 蔡尚郎

(青岛大学医学院附属医院心内科,山东 青岛 266003)

红花黄色素(safflower yellow,SY)是从红花中提取的有效成分〔1,2〕,是临床常用的活血化瘀药物。现代药理研究表明,红花水煎剂能抑制血小板聚集,降低血液黏稠度〔3〕,其有效成分SY能延长凝血酶原时间和凝血酶时间〔4〕。SY具有提高心肌和血浆中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,加速自由基的清除等作用〔5〕。本实验通过观察 SY对家兔缺血再灌注心肌超微结构和凋亡及相关基因表达的影响,验证其对心肌缺血的保护作用,并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 健康新西兰大白兔 24只(购自河南医科大学动物中心),雌雄不分,体重 2.0～2.5 kg,随机分为 3组,每组 8只。缺血再灌注组(IR组):结扎左冠状动脉前降支1 h,再灌注 6 h。SY组:于再灌注前 10 min耳缘静脉注射 SY 10 mg/kg,余同 IR组。药物组(MI组):于再灌注前 5min耳缘静脉注射磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制剂 LY 294002(0.3 mg/kg),余同 SY组。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型制备 采用乌拉坦(1 g/kg)耳缘静脉注射麻醉。仰卧位固定,心电图导线与兔四肢相连,记录12导联心电图,连接心电监护。除毛,沿胸骨正中偏左 0.5 cm切开皮肤,暴露左侧 3、4肋骨,钝性分离肋间肌,小弯钳于肋下穿 10号缝合线 2根,分别结扎,沿结扎线正中剪断 3、4根肋软骨;牵拉两侧结扎线,暴露胸腔,分离脂肪组织,可见心包及搏动之心脏。提起心包膜正中,用眼科剪将心包膜前部剪开,将心包膜用缝线固定于胸壁,充分暴露心脏。用止血钳将左心耳轻轻提起,观察冠脉的走行。以左冠状动脉主干为标志,在左心耳根部下方 2 mm处,用持针器持小圆针在冠状动脉前降支根部穿一结扎线,结扎线穿过心肌表层,在肺动脉圆锥旁穿出;在该结扎线下方约 0.5 cm处再穿一结扎线,双重结扎左前降支1 h,再灌注 6 h。心电图胸前导联出现ST段弓背向上抬高为结扎成功。

1.2.2 心肌细胞光镜学观察 各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织行苏木素-伊红(HE)染色,观察心肌细胞形态学改变。实验步骤如下:取材→固定→脱水和透明→透蜡→包埋→切片及贴附→脱蜡复水→染色→水洗→分化→漂洗→复染→透明→封藏,切片经中性树胶封藏,等树胶干后就可在镜下进行观察。

1.2.3 心肌细胞电镜学观察 各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织进行超薄切片观察心肌细胞超微结构改变。实验步骤如下:①取材:取缺血再灌注区组织,制成 1 mm3的组织块;②2.5%戊二醛 4℃固定 4 h;③磷酸缓冲液(PBS)漂洗 3次;④1%锇酸固定 3 h;⑤PBS漂洗 3次;⑥脱水;⑦浸透:用二甲基酮与 Epon812包埋剂混合液(1∶2)浸透;⑧包埋:将样品移到 Epon812包埋剂中进行包埋;⑨超薄切片:用 UltracutE超薄切片机进行超薄切片,厚度为 50～100 nm,干燥后即可染色;⑩染色:醋酸双氧铀染色 15 min,蒸馏水彻底水洗 3次;枸橼酸铅染色 15min,再用蒸馏水彻底水洗 3次。切片干燥后即可置于电子显微镜(日本JEOL公司JEM-1200EX透射电镜)下观察。1.2.4 原位末端标记凋亡细胞末端转移酶标记技术(Tunel法)检测 严格按照试剂盒说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。每张切片随机选择 5个视野(×400),记录阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数,以凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比来确定凋亡指数(AI)。AI=Tunel阳性细胞数/心肌细胞总数 ×100%。

1.2.5 心肌细胞中 bcl-2、bax蛋白表达的免疫组化(SP)法检测 将取材中 10%中性甲醛固定的标本固定 24h后行常规石蜡包埋、切片,厚度约 4.5μm,贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。①二甲苯和酒精脱蜡;②3%过氧化氢孵育 10 min以消除内源性过氧化物酶活性,PBS液冲洗;③5%～10%正常山羊血清封闭,室温孵育 10 min;④加入一抗:bcl-2、bax均为 1∶100稀释后加入玻片中,4℃过夜,PBS液洗 3次,每次 5 min;⑤加入二抗:滴加适当比例稀释的生物素标记二抗,37℃孵育 30 min,PBS洗 3次,每次 5min。⑥显色:加入二氨基联苯胺(DAB)显色剂 5～10 min;⑦HE复染 2 min,脱水、透明、封片、镜检。每张切片随机选取 5个视野(×400)采用 VIDAS图像分析系统(德国欧波同公司)测定其阳性表达面积、平均光密度和积分光密度,并采用公式:单位面积平均光密度 =〔积分光密度/(512×512)〕×100%进行数据换算。

1.3 统计学处理 实验数据均以 x±s表示,使用 SPSS12.0统计学软件进行分析,组内比较采用方差分析,两组间比较采用 q检验(Student Newman-Keuls法)。

2 结 果

2.1 光镜学观察 IR组心肌细胞间质水肿,细胞界限不清,可见较多粒细胞灶状浸润,并可见少量红细胞渗漏。SY组心肌细胞轻度水肿,界限清楚,心肌细胞排列相对规则,见少量粒细胞浸润,无红细胞渗漏。MI组心肌细胞水肿严重,部分细胞溶解,细胞界限欠清楚,横纹消失,可见较多粒细胞浸润,并可见红细胞渗漏。

2.2 电镜下观察 IR组心肌细胞水肿明显;线粒体明显肿胀,溢出到细胞外,嵴明显减少,基质中致密颗粒减少甚至消失,伴空泡样形成;肌膜破坏,出现膜断裂、缺损,肌原纤维模糊,部分 Z线不明显;细胞核肿胀,异染色质增多,核不规则,甚至核碎裂。SY组超微结构变化轻微,仅见心肌细胞内轻度水肿;线粒体轻度肿胀,嵴部分消失;肌原纤维排列规则,肌小节清楚,仅见少量肌丝断裂,Z线明显,闰盘清晰;细胞核内物质分布均匀,无核裂解及固缩现象。MI组细胞水肿明显,胞膜固缩消失;线粒体弥漫性肿胀,;糖原减少,肌原纤维极度松弛、拉长,Z线扭曲、变形,肌丝横断、撕裂、溶解;核固缩,可见凋亡小体;间质明显水肿。

2.3 凋亡细胞 Tunel检测结果 IR组AI为 21.37±3.86,SY组 AI明显降低(15.47±3.63)(P＜0.01),而 MI组 AI(23.38±3.77)与 IR组接近(P＞0.05)。

2.4 心肌细胞中 bcl-2、bax蛋白的表达 bcl-2阳性细胞表现为胞浆及胞膜呈棕褐色,bax阳性细胞表现为胞浆呈棕褐色。着深棕色者为强阳性表达细胞,不着色者为阴性表达细胞,介于两者之间者为弱阳性表达细胞。各组心肌细胞bcl-2、bax蛋白表达见表 1。

表1 各组心肌细胞 AI、bcl-2、bax蛋白表达(x±s,%)

3 讨 论

心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标,心肌缺血 30～40 min,心肌细胞可发生缺血性损害。光镜下观察见正常心肌细胞内中性粒细胞及红细胞浸润等损伤。线粒体对缺血缺氧十分敏感,是决定细胞由可逆到不可逆改变的关键细胞器,线粒体弥漫性肿胀,膜破裂、嵴溶解、消失,基质出现嗜锇性颗粒等均是缺血造成的损伤。本研究发现,SY可以减轻心肌细胞超微结构的变化,从而对心肌产生保护作用。

细胞凋亡是机体的正常细胞在受到生理性或病理性刺激后启动的自发死亡过程是缺血再灌注损伤发病机制中的一个重要环节〔6〕。大多数细胞在凋亡过程中需要新基因的表达和蛋白质的合成。bcl-2基因是凋亡抑制基因,其过量表达可阻断因缺血、细胞因子短缺、辐射、抗肿瘤药物、c-myc等不同刺激诱发的细胞凋亡。bcl-2抑制凋亡的机制是它可直接或间接地阻止细胞色素 C自线粒体的释出,而后者可与 ATP一起改变Apaf-1的构型而使caspase-9激活。bax基因为促进凋亡基因,主要表达于线粒体膜和内质网膜上。bax与 bcl-2有很高的同源性,能与 bcl-2形成异源二聚体,通过抑制后者的活性,使凋亡易于发生。bcl-2和 bax的表达程度决定了细胞命运,bcl-2占优势时阻止细胞凋亡发生,而 Bax占优势时细胞趋向凋亡〔7〕。本研究采用 Tunel法、SP技术检测了心肌细胞 AI及bcl-2、bax蛋白的表达,结果显示各组均有一定的心肌细胞凋亡,而 SY组 AI明显较低,证实了 SY可以减轻缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡程度;同时发现SY组 bcl-2蛋白表达增强,而 bax蛋白表达明显减少,进一步显示,SY对缺血再灌注心肌凋亡相关基因的表达具有显著的作用,即明显上调 bcl-2的表达、下调bax的表达,从而发挥对心肌的靶保护作用。

目前认为缺血预处理的机制是短暂的缺血再灌注使大量的内源性物质如腺苷、缓激肽、阿片等释放〔7〕,然后作用于相应的受体,诱导蛋白激酶C(PKC)的激活,再进一步激活其他激酶,最终激活再灌注损伤补救酶(RISK)途径,使效应器磷酸化,效应器可能主要是线粒体上的 ATP敏感性钾通道(mKATP),诱导心肌保护机制〔8〕。 PI3K是 RISK信号转导通路的组成之一〔9〕。本研究通过应用药物 PI3K抑制剂 LY294002发现,该药物能够阻断 SY对心脏的保护作用,因此推测RISK参与了 SY对心肌的保护作用,其具体机制尚待进一步研究。

1 李中原,涂秀华.红花黄色素的药理研究进展〔J〕.中药新药与临床药理,2005;16(2):153-6.

2 李 芳,孙明智.红花黄色素对豚鼠心室乳头肌缺氧和复氧损伤的保护作用〔J〕.哈尔滨医科大学学报,1999;33(1):6-8.

3 顾红璋.中药红花煎剂对血小板聚集功能的影响〔J〕.中国血液流变学杂志,1994;2:48.

4 黄正良,崔程梅,任 远.红花黄色素的抗凝血作用研究〔J〕.中成药,1987;18(4):22.

5 刘月庆,李 康,毕开顺.红花黄色素 A在大鼠体内的药动学研究〔J〕.中草药,2003;34(8):725-7.

6 吴 青,陶红凯,陶大昌,等.缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的研究〔J〕.中国心血管病研究杂志,2004;2(11):905-8.

7 孙忠东,高尚志,池一凡,等.肾缺血预处理对兔未成熟心肌 Bcl-2,Bax,Fas蛋白表达的影响〔J〕.第四军医大学学报,2005;26(22):2039-41.

8 Philipp S,Yang XM,Cui L,et al.Postconditioning protects rabbit hearts through a protein kinase C-adenosine A(2b)receptor cascade〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2):308-14.

9 Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al.Postconditioning:a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinosito-kinase-Akt pathway〔J〕.Circ Res,2004;95(3):230-2.