板栗毛壳水提液对大鼠脑缺血再灌注后过氧化氢酶和单胺氧化酶的影响

周丽霞 黄宏妙 李 灵 罗佩卓 梁晓艳 黄 焕

(广西中医学院药学院,广西 南宁 530001)

板栗毛壳是壳斗科植物板栗(castanea mollissima blume)的总苞。据《中华本草》记载,板栗毛壳具健脾益气、补肾强筋、清热散结、止血之功效,治疗丹毒、肿毒等疾病〔1〕。板栗壳含有黄酮类、微量元素、多糖、氨基酸等多种化学成分〔2〕,板栗壳及板栗毛壳的水煎液、醇溶物、乙酸乙酯提取物还具有极强的抗菌、消炎作用和抗凝血、升高白细胞等生物活性〔3,4〕,而且低毒〔5〕。板栗壳色素具一定的抗氧化作用〔6〕,但其毛壳的抗氧化、抗衰老作用迄今未见有报道。本研究将通过观察板栗毛壳水提液在大鼠脑缺血再灌注损伤后对过氧化氢酶(CAT)、单胺氧化酶(MAO)的影响,初步研究其抗氧化、抗衰老的作用,使其药用价值得到有效开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 双缩脲试剂盒、MAO测定试剂盒、CAT测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;板栗毛壳采集于广西隆安县那桐乡那重村,经广西中医学院药用植物学教研室刘寿养教授鉴定为壳斗科植物板栗(Castanea mollissima Blume)的总苞。

1.1.2 动物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,体重(200±20)g,由广西中医学院实验动物中心提供。

1.3 主要仪器 紫外可见分光光度计 UV-160(日本 shimadzu公司);1411高频小电刀(上海医疗器械高技术公司);江弯-Ⅰ型 C通用立体定向器(第二军医大学);TGL-16型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);FSH-Ⅱ高速电动匀浆器(江苏省金坛市医疗仪器);WXH微型旋涡混合器(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 方法

1.2.1 板栗毛壳水提液的制备 将洗净干燥后的板栗毛壳粉碎,称取干燥粉末 100 g,用 8倍量纯净水浸泡 1 h,加热煮沸30 min,滤出水煎液,继续分别加 6倍量纯净水再煮 2次,合并水煎液,浓缩至 100ml(相当于 1 g生药/ml)。

1.2.2 动物分组 将 48只SD大鼠随机分为 4组:无药无手术组(空白对照组)、无药手术组、给药手术组、给药无手术组。给药组:每天按 10 ml/kg鼠,用板栗毛壳水提液灌胃。无药组:每天灌服等量生理盐水。灌胃 14d后进行实验。

1.2.3 脑缺血再灌注模型的建立 采用四血管阻断法〔7〕,即将麻醉大鼠定位头颅,电凝阻断左右椎动脉;再仰卧定位,挂线结扎双侧颈总动脉 15min,灌注 3 h后断头处死。

1.2.4 组织匀浆的制备 处死大鼠后,速取其脑、肝、肾、心,用 4℃生理盐水洗净,吸干,准确称重,加入 9倍量生理盐水,冰冷条件下以 3 000 r/min制成10%的匀浆。在 4～6℃条件下高速低温离心 20min,取上清液,置冰箱 4℃保存备用。

1.2.5 蛋白质、CAT、MAO含量的测定 参照蛋白定量(双缩脲法)、CAT、MAO测试盒说明书。

1.2.6 统计方法及软件 数据用x±s表示,采用组间 t检验,用中国医学百科统计软件包(PEMS V2.1)进行统计分析。

2 结 果

2.1 板栗毛壳水提液对大鼠脑、肝、肾、心中CAT活性的影响见表 1。

2.2 蛋白定量测定结果 见表 1。各组大鼠各组织蛋白量均比较接近,各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 板栗毛壳水提液对大鼠心、脑、肝、肾中MAO活性的影响见表 1。

表1 板栗毛壳水提液对大鼠器官组织匀浆 CAT、蛋白含量、M AO活力的影响(x±s,n=6)

3 讨 论

蛋白定量测定主要是为了求出各组织匀浆蛋白浓度,给CAT和 MAO含量的计算提供数据。由表 2数据可知,与无药无手术组(空白对照组)比较,无药手术组的 CAT活力明显降低(P＜0.01),表明脑缺血再灌注损伤后能显著降低大鼠脑、肝、肾、心组织的 CAT活力;而给药手术组或给药无手术组均比无药手术组的 CAT活力明显升高(P＜0.01或 P＜0.05),表明喂食板栗毛壳水提液后,大鼠机体组织的CAT活力显著增强。由表 3数据可知,与无药无手术组(空白对照组)相比,无药手术组各组织匀浆的 MAO活力显著增高(P＜0.05),提示脑缺血再灌注损伤后使自由基增加而增强了 MAO的活性。而给药手术组或给药无手术组均能显著降低MAO的活性,与无药手术组相比有显著差异性(P＜0.01或P＜0.05),表明板栗毛壳水提液对大鼠组织匀浆的MAO活力有抑制作用。

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血致脑细胞损伤,恢复血液再灌注后,其缺血性损伤反而进一步加重的现象〔8〕。脑缺血再灌注引起脑组织损害的病理机制包括自由基产生、细胞内钙超载、能量耗竭、免疫介质产生、谷氨酸盐释放、离子稳态破坏、酸中毒、凋亡通路激活等。其中,自由基连锁反应是脑缺血再灌注损伤的核心环节,而钙超载则可能是导致神经元死亡的最后通路〔9〕。自由基的过量产生或抗氧化物酶的活性降低都可引起不同程度的细胞毒性及瞬时不可逆损失。因此,只有及时治疗,促进体内抗氧化物酶活性的增强,清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应,才能消除炎症、减轻组织缺血再灌注造成的损伤。

CAT的测定结果提示,在脑缺血再灌注损伤后,大鼠脑、肝、肾、心组织中,具有清除自由基作用的 CAT活性减弱,会导致自由基大量产生而对组织造成损伤。而给予板栗毛壳水提液灌胃后,可提高大鼠脑、肝、肾、心组织中 CAT的活性,增强机体抗氧化能力,从而减轻脑缺血再灌注造成的损伤。

MAO的测定结果提示,在脑缺血再灌注损伤后,大鼠脑、肝、肾、心组织可能由于大量自由基的产生增强了 MAO的活性。MAO活性上升会引起中枢儿茶酚胺水平下降造成生化损害。MAO活性增高,是导致急性脑缺血早期脑内去甲肾上腺素(NE)浓度下降,以致出现卒中症状的一个重要原因〔10〕。而给予板栗毛壳水提液灌胃后,能有效抑制 MAO的活性,以减少神经元的损害,达到延缓衰老的效果。

板栗毛壳水提液能提高 CAT活性,显著降低 MAO活性。其醇溶性物质是否也具同样作用?其降低神经元坏死的程度、减少脑缺血再灌注损伤后的卒中症状,还有待于进一步研究。本研究希望能为药材的功效、进一步的开发利用提供一定的科学依据。

1 国家中药管理局 .中华本草〔M〕.上海:上海科学技术出版社,1999:2422.

2 赵德义,高文海,花成文,等 .板栗壳化学成分的初步研究〔J〕.陕西林业科技,2003;(2):43-7.

3 吴龙云,凌桂生,许学健,等 .板栗毛壳的抗菌活性成分〔J〕.中草药,1991;22(8):370.

4 吴龙云,凌桂生,许振朝 .板栗壳浸膏抗菌抗炎作用及对胃肠平滑肌运动的影响〔J〕.广西中医药,2002;25(4):54.

5 李爱媛,贝伟剑,赵 一,等 .板栗毛壳长期毒性的实验研究〔J〕.湖南中医药导报,1996;2(4):31.

6 何玲玲,王 新,石中亮,等 .水提板栗壳色素对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用〔J〕.食品与机械,2006;6:56-57.

7 刘亚君,崔 鹤,谢东萍,等 .Bcl2和 Bax在缺血预处理保护海马神经元缺血再灌损伤中的作用〔J〕.山东大学学报(医学版),2006;44(3):227-30.

8 韩 敏,刘艳凯,薛 茜 .脑缺血再灌注损伤的研究进展〔J〕.河北北方学院学报(医学版),2006;23(10):75-8.

9 Cristina T,Rosaria G,Dechun W,et al.Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats a time course study〔J〕.Eur J Pharmacol,2003;464(2-3):159-62.

10 许世凯.抗衰老药物学〔M〕.北京:中国医药科技出版社,1994:158.