氟伐他汀对诱导分化的 HL-60细胞 VEGFmRNA表达的抑制作用

赵丽艳 林 海 石 艳 苗春生 李蕴潜

(吉林大学第二医院检验科,吉林 长春 130041)

肿瘤血管生成能力增强不仅导致肿瘤细胞数量迅速增加,而且增加了肿瘤转移的危险性。肿瘤细胞能产生多种血管生长因子,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是与血管生成关系最密切的生长因子,VEGF不仅对实体瘤的发生发展产生明显影响,而且在多数造血系统恶性肿瘤中也起重要作用〔1〕,抑制 VEGF表达或活性已成为造血系统恶性肿瘤治疗的新策略〔2,3〕。以往研究表明,氟伐他汀(fluvastatin,Flu)能抑制 HL-60人早幼粒细胞白血病细胞(HL-60细胞)增殖并诱导凋亡〔4〕,但 Flu对诱导分化的 HL-60细胞 VEGF mRNA表达的影响尚未见报道。本研究着重探讨Flu对诱导分化的 HL-60细胞血管内皮生长因子 VEGF mRNA表达的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HL-60细胞(中国医学科学院天津血液研究所),RPMI 1640培养基(Gibco公司),小牛血清(Hycolon公司),Flu(北京诺华制药有限公司),全反式维甲酸(ATRA),甲羟戊酸(mevalonate,Mev),硝基四氮唑蓝(NBT),牛血清白蛋白、二甲基亚砜(DMSO)、佛波酯(Sigma公司),VEGF及 β-actin引物(上海生工生物技术公司合成)。

1.2 细胞培养 HL-60细胞在含 10%小牛血清、100 U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的 RPMI 1640培养液中,37℃、5%CO2培养箱饱和湿度下培养。

1.3 细胞的处理 收集对数生长期细胞,用含 10%小牛血清的 RPMI 1640培养液配成 105/ml浓度的细胞悬液,接种于培养瓶中,随机分为空白对照组、阳性对照组、Flu处理组和Flu+Mev处理组。Flu处理组和 Flu+Mev处理组加入终浓度为20μmol/L的 Flu,Flu+Mev处理组在加入 Flu的同时加入终浓度 Mev 100μmol/L,阳性对照组加入终浓度 ATRA 10μmol/L,空白对照组加入等体积DMSO,作用 72h后收获细胞。

1.4 NBT还原能力测定 各组经不同处理的HL-60细胞接种于 24孔板处理 72 h后,每孔加入含 1.25mg/ml NBT、17 mg/ml牛血清白蛋白及 2μg/ml佛波酯的 PBS溶液,37℃温育 2 h。离心弃上清液,加入 3 ml DMSO溶解结晶物,用 721型分光光度计测 580 nm处吸光度(A),以 A值大小表示细胞NBT还原能力。NBT还原能力测定是判断细胞分化的标志物和敏感指标,在一定波长下其吸光度值越大细胞的还原能力越强,而未分化的白血病细胞则缺乏这种还原能力,故吸光度值低。

1.5 VEGF mRNA表达的检测 取经不同处理的 HL-60细胞,按Trizol试剂盒说明书操作方法提取总RNA。用紫外分光光度计在 260 nm和 280 nm处测 A值,OD260/OD280在 1.8～2.0,根据A260值计算 RNA浓度。按逆转录试剂盒操作说明将 RNA逆转录成cDNA,以 cDNA为模板,分别用VEGF和 βactin的引物进行 PCR扩增。VEGF上游引物:5′-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3′, 下 游 引 物:5′-CCTGGTGAGAGATCTGGT TC-3′,扩增产物为 516、588和 648 bp。 β-actin上游引物:5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′, 下 游 引 物:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAA CGCA-3′,扩增产物为 432 bp。取 PCR产物进行 2%琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml溴化乙锭),3 V/cm电泳30～50 min,紫外灯下照相,用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断(VEGF和β-actin)进行灰度扫描,以 β-actin密度作为参考定量标准,数值以两者之积分吸光度的比值表示,以对照组的比值作为标准 1.0。

1.6 统计学方法 数据以 x±s表示,显著性检验采用 SPSS 11.0软件,组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 NBT还原能力 用 Flu处理 HL-60细胞 72 h后,其 NBT还原能力(0.63±0.09)较对照组(0.22±0.06)显著升高(P＜0.01),接近阳性对照组(0.76±0.16)的水平。 Flu+Mev处理组 HL-60细胞 NBT还原能力(0.34±0.04)与 Flu处理组比较明显降低(P＜0.01)。表明 Flu可诱导 HL-60细胞分化,而Mev能够逆转 Flu的诱导分化作用。

2.2 VEGFmRNA表达 HL-60细胞经 ATRA和 Flu处理 72 h后,VEGFmRNA表达水平(分别为 1.51±0.02和 1.58±0.04)均较阴性对照组(1.87±0.05)明显下调(P＜0.01)。Flu+Mev处理组 VEGF mRNA表达的下调(1.76±0.06),与 Flu处理组比较具有统计学意义(P＜0.05)(图 1)。

图1 氟伐他汀处理对 HL-60细胞 VEGF mRNA表达

3 讨 论

近年研究表明,某些恶性肿瘤细胞在诱导剂的作用下,可以重新分化为正常或接近正常的细胞,即肿瘤细胞的诱导分化,这种疗法已成为肿瘤治疗的新方向。本研究中,用 Flu处理 HL-60细胞 72 h后,其 NBT还原能力较对照组显著升高,接近阳性对照组的水平,表明 Flu已诱导 HL-60细胞发生了分化。用 Flu和 Mev共同处理后 HL-60细胞 NBT还原能力又明显降低,提示Mev可以逆转 Flu的诱导细胞分化作用。

研究发现,恶性血液病细胞VEGF呈高表达,并不同程度表达 VEGF受体〔1〕。抑制 VEGF生物学作用可能会直接抑制血液肿瘤的生长和存活〔5〕,并将抗血管治疗概念从实体瘤引入血液肿瘤研究中,这是近年对抗血管生成治疗白血病认识的进一步深化。本研究显示,HL-60细胞经 Flu处理 72 h后VEGF mRNA表达水平明显降低,表明Flu能抑制已分化的 HL-60细胞 VEGF基因表达。

目前有关研究显示,微摩尔浓度的他汀类药物能降低VEGF合成〔6〕。Araujo等观察到阿托伐他汀能通过下调 VEGF表达而抑制炎性血管生成〔7〕,但尚不清楚Flu通过何种机制引起 VEGF基因表达下调。本研究发现,HL-60细胞用 Flu和Mev共同处理后,可以逆转由 Flu诱导 VEGF mRNA表达的下调,即可使已下调的VEGF mRNA表达水平又增加到接近于空白对照组的水平,提示 Flu下调 VEGF基因表达的作用可能是通过“甲羟戊酸途径”介导的。Hata等〔8〕用视网膜内皮细胞研究辛伐他汀的抗血管生成作用时也证实,抑制甲羟戊酸依赖途径是 Flu这一作用的可能机制。甲羟戊酸是 HMG-CoA还原酶反应的重要产物,他汀类药物能抑制甲羟戊酸及其下游产物的生成,阻断蛋白质翻译后的异戊二烯化加工,干扰小 G蛋白Ras介导的细胞内信号传导,从而影响细胞的生物学功能〔9,10〕。

有研究表明〔10〕,除了降低胆固醇作用外,他汀类在体内体外都显示出抗白血病作用,Flu与其他抗肿瘤药物合用,可增强肿瘤细胞对放疗的敏感性,增强ATRA对急性早幼粒细胞白血病细胞诱导的分化,逆转 ATRA抗白血病作用的抗药性,减少化疗药物的用量及毒副作用,提示 Flu具有多方面有益作用,在急性粒细胞白血病的治疗中可能具有良好的应用前景。

1 Zini JM,Tobelem G.Angiogenesis and hematologic malignancy〔J〕.Bull Cancer,2007;94(Suppl):S241-6.

2 Kessler T,Fehrmann F,Bieker R,et al.Vascular endothelial growth factor and its receptor as drug targets in hematological malignancies〔J〕.Curr Drug Targets,2007;8(2):257-68.

3 Li WW,Hutnik M,Gehr G.Antiangiogenesisin haematological malignancies〔J〕.Br JHaematol,2008;143(5):622-31.

4 赵丽艳,石 艳,王忠山,等.氟伐他汀对人早幼粒白血病 HL-60细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.吉林大学学报 (医学版),2008;34(2):254-7.

5 Dias S,Choy M,Alitalo K,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-C signaling through FLT-4(VEGFR-3)mediates leukemic cell proliferation,survival,and resistance to chemotherapy〔J〕.Blood,2002;99(6):2179-84.

6 Dulak J,Józkowicz A.Anti-angiogenic and anti-inflammatory effects of statins:relevance to anti-cancer therapy〔J〕.Curr Cancer Drug Targets,2005;5(8):579-94.

7 Araujo FA,Rocha MA,Mendes JB,et al.Atorvastatin inhibits inflammatory angiogenesis in mice through down regulation of VEGF,TNF-alpha and TGF-beta1〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(1):29-34.

8 Hata Y,Miura M,Asato R,et al.Antiangiogenic mechanisms of simvastatin in retinal endothelial cells〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2010;248(5):667-73.

9 Hindler K,Cleeland CS,Rivera E,et al.Therole of statins in cancer therapy〔J〕.Oncologist,2006;11(3):306-15.

10 Buhaescu I,Izzedine H.Mevalonate pathway:a review of clinical and therapeutical implications〔J〕.Clin Biochem,2007;40(9-10):575-84.