液相色谱-串联质谱法对中药制剂中西地那非的测定

杜书君 唐斌斌 高海

（1阳谷县人民医院，山东 阳谷 252300；2陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710000）

枸橼酸西地那非是治疗男性勃起功能不良的一种药物。自1997年3月由美国食品与药品管理局(FDA)批准上市以来,该药因其疗效确切，至2000年上半年，全球已有100多个国家批准使用。但在使用过程中发现其可导致卧位低血压,尤以同时服用硝酸酯类或含硝酸根的药物更为明显，严重者可引起心肌梗死甚至死亡[1]。美国心脏病学院和美国心脏病学会已明确指出,24 h内使用过硝酸酯类药物者禁用西地那非。我国也对西地那非的生产、经营及使用进行了严格的规定。然而，目前在补肾壮阳类中药制剂和保健食品中违法添加枸橼酸西地那非的情况甚为严重。为有效打击这种不法行为，建立一套方便可行的中药保健品中西地那非成分测定方法是非常有必要的。

图1 西地那非对照品和样品的全离子扫描图

1 材料

1.1 仪器

Quattro Micro API系统液相质谱联用仪，包括ESI（电喷雾电离）源，Waters6890液相色谱仪，Waters公司Massl-ynx 4.1质谱解析工作站。

1.2 试药

西地那非对照品（纯度≥99%，购自中国药品生物制品检定所，110857-200608）；西地那非供试品：锁阳固精丸（批号：060505，060508，060511），甲醇（色谱纯，山东禹王公司）；乙腈（色谱纯，广州飞狮化工有限公司）；水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

图2 西地那非对照品和样品的子离子扫描图

2 方法与结果

2.1 西地那非对照品溶液的制备

精密称取西地那非对照品5.01 mg，置50 mL容量瓶中，用流动相超声溶解然后定容至刻度。配制成含西地那非50 μg/mL的对照品储备溶液。精密吸取该储备液适量，用流动相逐级稀释，制成浓度为 1，2，3，4，5 μg/mL 的系列对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取样品一丸，称重，再将其粉碎成小颗粒，精密称重。置100 mL容量瓶中，加流动相超声溶解至无大颗粒状物质，加流动相定容至刻度，混匀，放置过夜。经过沉淀后取上层溶液适量，10 000 r/min，离心10 min，上清液过微孔滤膜，滤液用流动相稀释100倍，即得。

2.3 测定条件

2.3.1色谱条件C18色谱柱（2.1×100 mm，3.5 μm）流动相：0.01 mol/L，乙酸铵∶乙腈∶甲醇（55∶10∶35），流速 0.2 mL/min,柱温 30℃，进样量 1 μL。

2.3.2质谱条件电喷雾离子源（ESI），扫描范围：m/z 100～1 000,毛细管电压3 KV，锥孔电压：40 V，离子源温度：110 ℃，脱溶剂温度：350 ℃，脱溶剂气体：450 L/hr，锥孔气：50 L/hr，自动进样器直接进样，负离子方式检测。通过Full Scan，SIR，Daughter对样品进行测定。结果在锁阳固精丸中检测出西地那非。根据样品SIR图中色谱峰的峰面积与对照品的峰面积进行比较，计算西地那非的掺入量。西地那非对照品和样品的全离子扫描、子离子扫描以及碎片离子扫描图，分别见图1，图2，图3。

图3 西地那非对照品和样品的碎片离子扫描图

3 方法学考察

3.1 线性关系

将“2.1”项下的系列对照品分别进样1 μL，每一浓度做3次平行实验。以对照品浓度X为横轴，色谱峰面积Y为纵轴进行线性回归，得回归方程为：

Y＝3 344 085X－3 805.19 r＝0.999 7结果表明西地那非浓度在1～5 μg/mL范围内有良好的线性关系。

3.2 精密度试验

将浓度为3 μg/mL的对照品溶液连续重复进样5次，进样量为1 μL，西地那非峰面积RSD为1.26%（n＝5）。

3.3 稳定性试验

将“2.2”项的供试品分别在 0，2，4，6，8 h 进样，测定西地那非的峰面积，其峰面积的RSD为1.2%，结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

3.4 重复性试验

对同一批样品分别取样5份，按照“2.2”项下方法进行溶液制备，在上述测定条件下进行分析测定，结果测得该批样品的西地那非含量为1.37%，RSD为1.3%（n＝5）。

3.5 回收率试验

精密称取已知含量的样品9份，每份50 mg，分别加入50 μg/mL 的对照品溶液 10，15，20 mL，每种浓度各 3 份，按“2.2”项下制备溶液，各进样1 μL，3个浓度的平均回收率分别为103%，105%，98%，RSD分别为1.61%，1.76%，1.49%。

3.6 样品测定

取3个批号的样品，采用的对照品溶液参见“2.1”项，按“2.2”项下操作制备供试品溶液。进样1 μL，根据回归方程计算样品中西地那非的含量，结果3批样品中西地那非含量（n=3）分别为 1.32%，1.36%，1.48%，RSD分别为1.98%，1.86%，1.75%。

4 结果与讨论

中药制剂及保健品中擅自添加枸橼酸西地那非等物质，日常多使用薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法(HPLC)进行检测。然而仅从TLC、HPLC法的保留时间一致上还不能充分肯定样品中是否含有西地那非，需要通过液质联用方法进一步确认。国家标准规定，若供试品HPLC色谱峰保留时间与西地那非对照品色谱峰一致，并且供试品该色谱峰液质联用的一级质谱及二级质谱均与相应西地那非对照品一致，则可认为供试品中含有西地那非[2]，故日常检测工作中往往在使用TLC和HPLC进行保留时间定性后还需进一步使用质谱对物质的结构进行最终的明确。本文采用日益广泛使用的液质联用仪器，同时完成了样品中违禁成分西地那非的定性和定量分析，该方法准确可靠，重复性好，可作为中成药、保健品质量控制的有效方法。

[1]迟丹怡.西地那非的不良反应[J].药物不良反应杂志，2003，5(5)：352-354.

[2]国家药典委员会.国家药品标准(试行)[S].2000.