黄瓜瓜长性状的QTL定位分析

程周超 顾兴芳 张圣平 苗 晗 张若纬 刘苗苗 杨双娟

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国的重要蔬菜作物，培育高产、优质、多抗的黄瓜品种是黄瓜育种者的共同目标（顾兴芳 等，2005）。近年来，分子标记辅助选择（MAS）育种技术的应用，极大地加速了育种进程，然而这依赖于饱和的遗传图谱和准确的性状QTL定位（Tanksley et al.，1989）。由于黄瓜的遗传基础狭窄，自 1994年 Kennard将分子标记技术用于遗传图谱的构建到2009年第一张饱和SSR分子图谱的完成（Ren et al.，2009）期间，构建的主要黄瓜遗传图谱（Park et al.，2000；Bradeen et al.，2001；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007）存在饱和度低、通用标记少、连锁群与染色体不对应等缺点，第一张饱和SSR遗传图谱（Ren et al.，2009）虽然克服了上述缺点，但是没有对黄瓜的农艺性状进行QTL分析，因此不能将其直接应用于分子标记辅助选择育种。

黄瓜果实长度是其重要的外观品质性状。由于消费习惯和用途的不同，各地对黄瓜长度的要求不一，因此，研究控制果实长度的基因，可以为黄瓜品质育种提供理论依据。前人对黄瓜瓜长的QTL进行了一些研究（Kennard & Havey，1995；Serquen et al.，1997；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007），这些报道中检测到的瓜长QTL在4～6个之间，但由于所用试验材料不同，造成QTL数和位置也不同，同时缺少相同的锚定标记，且已报道的QTL也没有与相应的染色体对应，使得难于对不同图谱间的QTL进行准确的比较。

本试验以黄瓜野生变种PI 183967和新泰密刺选系931杂交获得的F2群体为作图群体，构建了一张黄瓜SSR遗传图谱，并对瓜长进行了QTL定位分析，为黄瓜MAS育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及性状调查

试验材料为黄瓜野生变种PI183967（来源于美国威斯康辛大学）、新泰密刺选系931（来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所）和以两者为亲本的F2、F3群体。

2008年秋分别将两个亲本和F2种植于本所温室中，F2群体共包含179个单株；2009年春将179个F2：3家系及亲本种植在中国农业科学院南口实验基地温室内，每家系种植10株，均进行常规栽培管理。当果实长度达到商品瓜大小时测量瓜长，测量标准为正常商品瓜瓜蒂至瓜顶的长度（李锡香 等，2005）。取F3各家系内瓜长的平均值用于QTL分析。

1.2 遗传分析

采用DPSv6.55数据统计软件对亲本的瓜长数据进行差异显著性分析，应用Excel 2003检验瓜长在F2群体及F2：3家系中的分布是否符合正态分布。

1.3 遗传图谱的构建

1.3.1 SSR引物的来源 本试验所用的SSR引物来源于黄瓜全基因组序列，共2112对（Ren et al.，2009）。

1.3.2 SSR分析 从亲本和 F2群体 179个单株侧枝上取叶片，冷冻处理后，用改良的 CTAB法（Clark，1998）提取基因组 DNA；SSR 反应体系：总体积 15 µL，1.5 µL 10×PCR buffer，0.2 µL dNTP（2.5 mmol·µL-1），0.15 µL Taq 酶（5 U·µL-1），2 µL DNA（10ng·µL-1），正向、反向引物（50ng·µL-1）各1 µL，其余以ddH2O补足15 µL。PCR程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30s，34个循环；72 ℃保温5 min；扩增产物用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶160V恒功率电泳分离，银染显色后在观察灯箱上进行数据分析。

1.3.3 标记的选择 本试验使用的 SSR标记分两部分进行选择：①将利用亲本筛选的有多态性的标记与黄瓜高密度图谱（Ren et al.，2009）上的标记进行比较分析，从中挑选出条带清晰、稳定，而且没有定位在高密度图谱上的SSR标记，全部用于分离群体的遗传连锁图谱构建；②为了保证遗传图谱上标记分布的均匀性，又从亲本筛选出的有多态性的标记中挑选出了一些标记，这些标记的选择是根据它们在黄瓜染色体上的位置，以大约每5 cM的距离进行挑选。

1.3.4 数据统计方法及图谱的构建 共显性标记的统计方法：来自母本（PI183967）的带型记为a，来自父本（931）的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出的或模糊不清的记为u。显性标记的统计方法：若 P1为显性，则 F2单株中和 P1带型一致的记为 d，和 P2带型一致的记为 b；若P2为显性，则 F2单株中和 P1带型一致的记为 a，和 P2带型一致的记为 c。最后利用 JoinMap3.0（van Ooijen & Voorrips，2001），LOD阈值3.0，分析数据获得黄瓜遗传图谱。

1.4 QTL分析与命名

利用MapQTL 4.0分析软件进行QTL分析，首先以置换测验确定QTL存在的LOD阈值，然后利用区间作图法（IM）进行QTL分析，将最高LOD值所在位置的标记或与其紧密连锁的标记作为协同因子，再对IM检测到的QTL进行多座位QTL模型（Multiple-QTL model，MQM）检测，以连锁群上 LOD值最高的位置作为 QTL的位置，以 2-LOD的区间作为 95 %的置信区间（van Ooijen，1992）。QTL的命名参照Yuan等（2007）的方法。

2 结果与分析

2.1 F2遗传图谱的构建

利用两构图亲本PI183967和931进行多态性筛选，从2112对引物中，获得996对多态性引物，多态率为47.2 %；从中挑选出319对SSR引物对F2群体进行分析，排除群体分析中条带模糊不清的标记，最终得到238对可用标记，建立了包含7个连锁群，234个SSR标记的黄瓜遗传图谱（图1）。该图谱覆盖基因组长度829.7 cM，平均图距3.5 cM。每个连锁群的标记数在 20～51之间，LG3包含的标记数最多，有51个；LG7含有的标记数最少，只有20个；连锁群的长度在56.4～158.7 cM之间；图谱密度在2.7～6.5 cM·maker-1之间，LG4的平均间距最小，为2.7 cM·marker-1；LG2的平均间距最大，为6.5 cM·maker-1。应用MapInspect软件对该图谱和黄瓜高密度遗传图谱（Ren et al.，2009）进行比较，7个连锁群上共有86个标记与高密度图谱一致，本试验中的1～7个连锁群中分别有17、12、17、5、9、16、10个标记和高密度图谱的1～7条染色体对应，从而确定了本试验构建的7个连锁群和黄瓜7条染色体的对应关系（表1）。

表1 黄瓜F2SSR遗传图谱

2.2 瓜长QTL分析

2.2.1 遗传分析 差异显著性分析结果显示（表2），瓜长在两亲本间表现出极显著差异，F2群体及F3的瓜长平均值分别为12.74和10.4。标准差分别为2.75和2.24，均表现出明显的分离。并且其分布为单峰分布，F2群体的峰值为0.23，偏度为-0.26，绝对值均小于 2，是数量性状的典型特征；在F3群体中，峰值为1.25，偏度为 4.13，绝对值大于 2，说明对于标准的正态分布而言，该分布呈尖顶峰，但还是表现出明显的单峰分布，因此基本符合正态分布，可用于数量性状的定位分析（图2、3）。

2.2.2 F2群体 QTL定位 用 MapQTL 4.0复合区间作图法对 2008年秋季 F2的瓜长进行 QTL分析，共检测到2个QTL（表3），将其命名为fl1.1和fl1.2，分别位于LG1（Chr1）的SSR02734～SSR05709之间和 LG4（Chr4）的SSR19596～SSR20063之间，fl1.1和fl1.2分别和标记SSR05709和SSR20063更接近，这两点的贡献率分别为14.1 %和12.5 %；加性效应为负，表现为减效加性效应，说明这些位点上使果实长度偏短的效应主要来自于黄瓜野生变种PI183967；这两个QTL的显性势（显性效应和加性效应比值的绝对值）分别为0.21和0.23，根据Stuber等（1987）提出的QTL作用方式的判别标准，fl1.1和fl1.2均为部分显性效应。

表2 黄瓜瓜长在亲本间的显著性分析及F2群体和F2:3家系的平均值

图1 PI183967、新泰密刺931 F2连锁图谱及瓜长的QTL位点

图2 瓜长在黄瓜F2群体的分布

图3 瓜长在黄瓜F2:3家系的分布

2.2.3 F2:3家系QTL定位 用同样的作图方法对2009年春季F2:3家系的瓜长进行QTL分析，共检测到3个QTL（表3），将其命名为fl1.1、fl4.2和fl6.1，分别位于LG1（Chr1）的SSR03680～SSR19914之间、LG4（Chr4）的 SSR03820～SSR12180之间和 LG6（Chr6）的 SSR15516～SSR23284之间。其中，贡献率分别为9.4 %、13.3 %和7.1 %，其中fl4.2的贡献率最高，fl6.1的贡献率最低；加性效应均为负，表现为减效加性效应，和F2检测到的QTL的效应相同，也说明了果实长度偏短的效应主要来自于黄瓜野生变种 PI183967；fl1.1、fl4.2和 fl6.1的显性势分别为0.19、0.34和0.53，依据Stuber等（1987）提出的差别标准，fl1.1为加性效应，fl4.2和fl6.1均为部分显性效应。

表3 黄瓜瓜长在F2群体及F2:3家系的QTL定位

3 讨论

基于已经构建的黄瓜高密度遗传图谱（Ren et al.，2009），本试验有目的地选择作图标记，构建了SSR遗传图谱，该图谱每个连锁群上的标记分布都很均匀，不存在较大的间隙，从而有利于进一步的QTL定位；并且除了共有标记外，在该图谱上还有208对标记没有在高密度图谱上得到定位，这也为今后的图谱整合工作奠定了基础；通过和高密度图谱的比较，确立了连锁群和染色体的对应关系，实现了数量性状位点和染色体的对应，为分子标记辅助育种提供了更直观的依据。

不同的试验群体会造成QTL数和位置的不同（Dijkuizen & Staub，2002）。本试验中F2：3家系检测到的瓜长QTL为3个，多于F2检测到的2个，并且与Owens等（1985）、Lower和Edwards（1986）根据经验估计控制瓜长的基因数为4个的结论较为接近。fl1.2和fl1.1位置相邻（≤3 cM），在两个世代间能够相互对应，推测其可能为同一个QTL，只是由于受到环境的影响而导致了不同世代间相对位置的微小变化；LG4（Chr4）上的fl4.1和fl4.2相距较远，且F2：3家系在LG6（Chr6）上检测了fl6.1，而 F2在该连锁群上未检测到瓜长 QTL，这种不同可能是由于两个世代的环境条件（温度、地域等）差异，存在基因型和环境的互作效应而产生的。

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