安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达

郑 君，李建华，张西臣，宫鹏涛，李明英，刘颖丽

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种由隐孢子虫感染而引起的以腹泻为主要临床症状的原虫病，可寄生于哺乳类、爬行类等多种动物和人，引起严重腹泻、脱水和厌食等症状[1]。安氏隐孢子虫(Cryptosopridium and ersoni)主要感染断奶犊牛、育成牛和成年牛[2]。目前，对安氏隐孢子虫囊壁蛋白的研究主要集中在虫体的诊断上[3]，本研究以安氏隐孢子虫长春株囊壁蛋白部分编码基因为对象，构建了重组原核表达载体pET28a-AB，并通过大肠杆菌进行表达，从而鉴定目的基因的免疫原性和免疫反应性，为安氏隐孢子虫的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 虫株与实验动物 安氏隐孢子虫卵囊为吉林某奶牛场粪样中分离纯化，用2.5%重铬酸钾溶液4℃保存。10只雌性BALB/c小鼠，6周龄～8周龄，体质量20 g左右，实验小鼠均在清洁级动物房饲养。

1.2 菌株、质粒和化学试剂 pMD18-T载体和工具酶购自TaKaRa公司；pET-28a由本实验室保存。E.coliTop10与E.coliBL21(DE3)均购自天根生物公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗均购自天根生物公司；层析柱材料Ni2+-NTA购自Novagen公司。

1.3 目的基因AB重组表达载体的构建 根据Gen-Bank中登录的安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)基因的核苷酸序列(AB089289)，设计特异性引物：上游引物：5'-CGCGGATCCTTTACATTTTCAGGGAAGC-3'(含BamHⅠ酶切位点)；下游引物：5'-CCGGAATTC CCTTGCAGTGTAAAATTTG-3'(含 EcoRⅠ酶切位点)。RT-PCR扩增目的基因(AB)，回收RT-PCR扩增产物，经TA克隆及鉴定，构建重组质粒pET-AB，双酶切鉴定并测序。

1.4 重组质粒pET-AB在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达及纯化 参照文献[4]的方法，诱导重组菌，分别表达1 h、2 h、4 h和6 h，SDS-PAGE检测表达产物，收集菌体，通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白，以抗His抗体(1∶4000)和安氏隐孢子虫免疫小鼠血清(1∶250)分别作为一抗，western blot分析纯化的重组蛋白。

1.5 COWP的免疫原性检测 采用腹腔注射的免疫方法，分别免疫6只雌性BALB/c小鼠，免疫剂量为100 μg/只，共免疫3次，每次间隔2周，同时设立PBS对照组。免疫后1周取脾脏，检测细胞免疫水平。ELISA方法检测小鼠血清中抗体水平，具体方法参照文献[4]。

2 结果与讨论

2.1 COWP编码基因的克隆及重组质粒pET-AB的构建 RT-PCR扩增目的片段，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小约为404 bp，与预期结果一致(图1)。目的基因经TA克隆后构建重组原核表达质粒pET-AB，经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳显示：目的片段约400 bp。目的片段经测序后与GenBank中核酸序列进行比对，同源性为100%。

2.2 重组质粒的诱导表达 含重组质粒pET-AB和空质粒pET28a的大肠埃希菌BL21 DE3经IPTG诱导表达，诱导后1 h、2 h、4 h和6 h的细菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，在约16 ku位置可见明显的蛋白条带，而空质粒对照菌无此条带出现(图2)。

图1 AB基因PCR扩增电泳图Fig.1 Amplification of AB gene by PCR

图2 IPTG诱导后重组蛋白表达的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression after induction by 1.0 mmol/L IPTG

2.3 目的蛋白纯化 重组菌经IPTG诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在，通过纯化、复性后，经western blot检测，抗His抗体、安氏隐孢子虫免疫小鼠的多抗血清均可识别该重组蛋白(图3)，而含空载体的重组菌对照组则未见特异性条带，表明目的蛋白具有反应原性。

2.4 免疫原性检测 以2 μg重组蛋白包被，免疫鼠血清工作浓度为1∶100，HRP标记羊抗鼠IgG工作浓度为 1∶1000，反应结束后测定 OD492nm值。BALB/c小鼠免疫前与免疫后血清中特异性抗体水平分别为0.213±0.021和0.548±0.027，结果证明免疫前后抗体差异显著(p<0.05)。T细胞检验结果显示BALB/c小鼠免疫后CD4+和CD8+的值均显著高于对照组(p<0.05)。

图3 纯化的重组蛋白western blot分析Fig.3 Western blot analysis of the recombinant protein

安氏隐孢子虫囊壁蛋白的合成是虫体生活史中必须经历的阶段[5]。因此，对囊壁蛋白的研究有助于隐孢子虫的防治研究。本研究构建了重组质粒pET-AB并转化到E.coliBL21中，通过诱导表达、纯化及小鼠免疫试验，证明重组安氏隐孢子虫囊壁蛋白具有一定的免疫反应性和免疫原性，为隐孢子虫的防治提供理论基础。

[1]Fayer R.Cryptosporidium:a water-borne zoonotic parasite[J].Vet Parasitol,2004,126:37-56.

[2]Paul S,Chandra D,Tewari A K,et al.Prevalence of Cryptosporidium and ersoni:A molecular epidemiological survey among cattle in India[J].Vet Parasitol,2009,161:31-35.

[3]Satomi K,Gabriella L,Hussni O,et al.Utility of the Cryptosporidium oocyst wall protein(COWP)gene in a nested PCR approach for detection infection in cattle[J].Vet Parasitol,2003,111:153-159

[4]刘海鹏，曹建平，等.安氏隐孢子虫热休克蛋白编码基因的克隆、表达和分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2007，25(3)：163-170.

[5]张西臣，赵权.动物寄生虫病学[M].吉林：吉林人民出版社，2005：343-344.