结核分枝杆菌天然抵抗宿主防御和药物的机制及治疗策略

刘珊珊，韩文瑜，雷连成，孙长江，张俊敏，刁昱文，杜涛峰

(吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林长春130062)

结核病严重威胁着人类健康，据世界卫生组织最新统计，结核分枝杆菌(Mycobacterium)感染者约占全球总人口的三分之一，每年约有800万新发病例，200多万死亡病例，死亡人数居单一传染病之首[1]。结核分枝杆菌与人类长期持续的斗争中，不断进化，自我完善，能够有效抵抗宿主的免疫防御以及各种抗菌药物的作用。而在众多的抗菌药中，可以用于治疗结核病的仅有几种，而且都已经问世近半个世纪。由于药物选择的局限、治疗过程长、治疗费用昂贵、药物副作用的严重以及患者的不配合等，都给病原菌抗药基因变异提供了机会，致使全球范围内耐药结核分枝杆菌增多[2]。这就要求新一代的抗结核分枝杆菌药物，必须具备能缩短疗程，对感染期以及潜伏期的结核分枝杆菌具有杀伤力的特性。因此，深入了解宿主、结核分枝杆菌、抗菌药物的相互作用机制，才能够进行有效的治疗。

1 结核分枝杆菌抗巨噬细胞吞噬策略

结核分枝杆菌被巨噬细胞捕获后，存留在空泡状结核分枝杆菌吞噬小体中[3]，在吞噬体中的结核分枝杆菌能利用其膜阻碍系统使吞噬体不能与溶酶体融合。从而在无杀伤力的吞噬体中，结核分枝杆菌减少自身的代谢，并抵抗来自宿主诸如氧化剂或抗菌肽等的毒杀作用，使其在原本具有吞噬和清除入侵者的巨噬细胞中安全存活下来。从而从急性感染期演变为慢性感染期，并且等待合适的机会再次致病。

结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬是通过宿主表面受体介导的，包括甘露糖受体、补体受体和Fc受体等[4]。其中补体受体3(CR3)介导的摄入过程是体外试验中最重要的吞噬途径之一[5]，而该过程需要在吞噬细胞受脂器中有胆固醇的积聚，使用洛伐他定和β-环糊精等胆固醇螯合剂，导致结核分枝杆菌不能被巨噬细胞吞噬[6]。而胆固醇在该过程中具体的作用尚不明确，可能是通过信号转导和CR3受体共同作用，也可能是通过提高疏水性细胞膜区域的微黏度来允许有效的肌动蛋白形成，从而促进吞噬细胞的吞噬[7]。而胆固醇介导的吞噬作用同时还需要宿主管蛋白1的存在，有研究表明管蛋白1需要Ca2+依赖的磷酸酶钙神经素来抑制吞噬体的生物合成[8]。最近研究报道，通过环孢菌素A或FK506来抑制钙神经素，提高溶酶体的传递并减少了分子内结核分枝杆菌的存活率[9]。当结核分枝杆菌感染管蛋白1缺失小鼠时，钙神经素不能被激活，溶酶体快速传递并可杀死胞内结核分枝杆菌。

钙神经素通过去磷酸化激活T细胞反应，反过来激活IL-2和其它细胞因子的转录，而这些细胞因子是T细胞存活所必须的。而且，研究显示管蛋白1只存在活的结核分枝杆菌吞噬体膜表面[10]，表明这是一个激活过程，利用宿主蛋白使自己在吞噬细胞中存活，展示了一个病原微生物进化的完美例子。

宿主和结核分枝杆菌在激活的吞噬细胞中相互作用，致病结核分枝杆菌通过阻碍溶酶体和吞噬体的融合，阻碍了巨噬细胞的吞噬杀伤作用。当IFN-γ作用时[11]，巨噬细胞的吞噬作用被激活。IFN-γ是免疫防御系统抵抗感染的重要成分，事实上很多免疫机制如白细胞内皮细胞的相互作用、抗原提呈、细胞的生长和凋亡以及吞噬体和溶酶体的融合都是由IFN-γ调控的[12]。IFN-γ基因缺陷的鼠和人类都具有结核易感性。最近报道了一个关于IFN-γ抑制胞内病原菌生长所必须的效应器Lrg-47，是IFN-γ介导的P47 GTP酶家族中的一种鸟苷三磷酸酶蛋白，是各种胞内病原菌免疫调节器[13]。因此，在Lrg-47减少的的巨噬细胞中，IFN-γ不能促进吞噬体和溶酶体的融合，从而不能清除胞内结核分枝杆菌，更加证明溶酶体成熟对于宿主控制结核分枝杆菌增殖的作用[14]。

许多宿主激酶涉及到吞噬体成熟过程[15]，而结核分枝杆菌蛋白激酶也参与宿主信号途径，该系统由11个不同的真核样蛋白激酶组成。其中蛋白激酶G最近被发现具有阻碍吞噬体成熟和促进胞内菌存活的作用[16]。亚细胞定位研究显示蛋白激酶G存在于感染结核分枝杆菌的吞噬体管腔和巨噬细胞的胞质内，而在感染了死菌的巨噬细胞中则不存在。证明该蛋白激酶是结核分枝杆菌的一个毒力因子，由致病的结核分枝杆菌分泌到宿主胞质中，干扰了溶酶体和吞噬体的融合。这将是杀死巨噬细胞内结核分枝杆菌很好的药物靶位，其优势之一是不直接杀死病原菌，而是通过激活巨噬细胞其固有的杀菌活性，将胞内存活的结核分枝杆菌传递给溶酶体。优势之二是其抑制作用不需要穿过难以渗入的细胞壁，大大提高了其杀菌能力。

在体外试验中，感染后期的巨噬细胞逐渐被激活，结核分枝杆菌便逐步从定居的吞噬体中转移到胞质，导致巨噬细胞凋亡进程加快。一旦进入胞质，结核分枝杆菌就能募集宿主支架因子，导致肌动蛋白聚集，形成细胞间的传播[17]。该功能是依赖于结核分枝杆菌分泌的独立因子ESAT-6和CFP-10，一旦阻碍吞噬体与溶酶体融合失败后，结核分枝杆菌就会利用该功能，使得临近细胞受到感染。

2 结核分枝杆菌细胞壁的低渗入性

结核分枝杆菌通过系列的分子机制来中和众多抗菌药的活性，由于其独特的细胞壁结构，靶向结核分枝杆菌胞浆或是分子内肽聚糖层的药物在到达靶位之前就已经失去了大部分活性。该结构包括亲水的阿拉伯半乳聚糖覆盖在肽聚糖层表面，以阻止疏水化合物进入，而阿拉伯半乳聚糖是由一长串疏水的分枝菌酸包裹着，限制亲水性物质的渗透，这3层相互共价连接，作为阻止抗菌药物渗入的坚实屏障。另外，在这3层的外部存在一个由海藻糖去霉菌酸酯和糖肽脂构成的流动层。对结核分枝杆菌霉菌酸酯合成基因突变分析显示，在抗药性和霉菌酸酯含量之间存在着联系，耻垢结核分枝杆菌霉菌酸酯合成基因突变时便显示出药物摄入率提高和对红霉素、氯霉素、新生霉素和利福平等的敏感性增强[18]。

结核分枝杆菌对抗菌药的耐受性来源于协同作用机制的全效保护，而细胞壁只是这个高端效应的一小分支而已。事实上，无论细胞表面阻碍作用多么强大都会在细胞周期的某一时间段允许致死量的亲水性抗菌药物进入，如果没有其他的保护机制，这些在胞浆内积聚的抗菌药足够杀死细菌。由于细胞壁屏障明显的延缓了药物的进入，而分子内的抵抗系统才能更加有效的抵抗已进入的抗生素。

3 结核分枝杆菌的药物钝化和靶位修饰策略

β内酰胺抗生素通过抑制细胞壁和肽聚糖合成来杀死细菌，结核分枝杆菌对该类药物的抵抗一方面通过细胞壁的穿透障碍限制其渗入，同时还拥有有效的β内酰胺水解酶，体外试验和临床均证实β内酰胺抗生素和内酰胺水解酶抑制剂共同使用能有效杀死结核分枝杆菌[19]。基因分析显示在结核分枝杆菌中编码内酰胺水解酶的基因为blaC和blaS，因此内酰胺水解酶抑制剂和破坏细胞壁药物的联合应用将是一种有效的治疗方案。

大环内酯类药物抑制细菌蛋白质生物合成，通过可逆绑定在细菌核糖体50S亚基核糖体RNA特定区域，来抑制tRNA对氨基酸的翻译。但这类抗生素对于包括牛结核分枝杆菌在内的结核分枝杆菌通常没有效果。有趣的是，卡介苗(BCG)却对大环内酯类显示出高度敏感性，后来发现是因为缺失编码核糖体RNA甲基转移酶的Erm37基因[20]。该基因可以将23S核糖体甲基化，来改变核糖体的结构从而降低了抗生素对于该核糖体的亲和力。而通过体外试验分析表明Erm37通过约束大环内酯类来保护核糖体，以此减少该类药物对于蛋白质生物合成的抑制。

喹诺酮类药物通过与DNA促旋酶相互作用来抑制DNA的复制和转录。对结核分枝杆菌MfpA基因的研究揭示了结核分枝杆菌针对喹诺酮类药物神奇的防御策略，该蛋白拥有一个和DNA双螺旋结构类似的三维空间结构。该空间结构可以模仿DNA阻断喹诺酮类药物对于结核分枝杆菌DNA的破坏。尽管MfpA确切功能还不明确，但这个发现为我们展示了细菌面对生存压力，人类防御等不利条件时进化出了完美的适应性调整策略[21]。

最近报道了一个新的分枝杆菌耐药决定机制，该机制与其独特的抗氧化压力系统相关。大多数细菌通过谷胱甘肽减少巯基化来抵抗氧化压力，而放线菌不能利用谷胱甘肽。事实上它们产生了一个巯基包含物(Mycothiol)，可能直接参与对多种抗菌药物如万古霉素、利福平和β内酰胺酶抗生素等抵抗作用[22]。抑制Mycothiol的活性，可以导致分枝杆菌对药物的敏感性显著提高，而宿主巨噬细胞对分枝杆菌的杀伤性也相应增强[23]。

4 对于多重药耐药的转录调控

微生物能监控多重有害因素，并做出反应，对于它们生存在复杂的宿主环境中是至关重要的。越来越多的证据显示结核分枝杆菌利用复杂机制来识别并保护自身免于被抗生素和机体免疫系统攻击。这些复杂体系通常是由一些结构蛋白构成，来识别众多的抗菌药物中的不同靶位。事实上，在以往的研究中发现细菌经常利用染色体包装策略来对诸如抗生素治疗等多重压力做出反应[24]。因此，有理由推断结核分枝杆菌中存在一个主要的调控系统，直接或间接识别多种抗菌药物和宿主防御，并调整各个蛋白的表达及其活性。近来报道了一个这样的系统[25]，组蛋白类似蛋白Lsr2，是一个分子量为12 ku的基本蛋白，仅存在于包括结核分枝杆菌在内的放线杆菌中。试验显示Lsr2的功能是作为DNA连接蛋白来连接远处的DNA片段，提示该蛋白在组织和包装结核分枝杆菌染色体上起了重要作用。同时发现它具有抑制乙胺丁醇导致的iniABC操纵子转录的功能，该基因编码了结核分枝杆菌多种药物流出泵。比较基因组学分析显示Lsr2可能编码包括细胞壁生物合成和基础代谢在内的数百个基因的转录[26]。而Lsr2基因的缺失会导致iniABC操纵子的转录增加，结果导致结核分枝杆菌对多重药物的耐受增加。

耐药性可能反映了宿主内发生的生理性调整，也可能包含了一个存在于持续感染过程中未界定的阶段。而wbiB早期孢子基因就是一个例子，在链霉素中该基因主要是装备启动细胞分裂和孢子形成所必须的隔片。wbiB样基因存在于结核分枝杆菌中，提示着也存在着类似的功能和程序机制。事实上wbiB基因在耻垢结核分枝杆菌中对于隔的形成和细胞分裂是必需的。其中一个wbiB样基因wbiB7最初是在变铅青链霉菌中发现，作为一个多重耐药决定因子，wbiB7突变变铅青链霉菌能够正常生长，却表现出对临床上相关甚至不相关的抗菌药(氯霉素，大环内酯类，洁霉素，利福平，四环素等)的高度敏感性。在包括结核分枝杆菌在内的许多结核分枝杆菌属中敲除wbiB7基因均导致多重药物敏感表型，证明该基因是一个原始的耐药性决定基因。然而像whiB7这样一个如此小的蛋白如何抵抗作用机制不同，靶向不同的多种药物呢？用cDNA微阵列分析基因表达，显示whiB7至少控制着8个基因调节子的表达，而其中至少有4个基因的功能和其内在抗药性有关[27]。有趣的是，whiB7基因和其调节子的表达是由与之接触的亚抑菌浓度的药物诱导的，而且呈时间和剂量相关性。大量试验显示wbiB7的表达也被脂肪酸诱导，表明whiB7对结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活是必须的。wbiB7对于结核分枝杆菌存活和与宿主相互作用的功能最新的研究显示，通过控制eis基因的转录，来调整结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活[28]，同时影响宿主细胞因子的分泌和T细胞的功能[29]。抗生素治疗导致的结核分枝杆菌对药物治疗和机体免疫抵抗力均获得增加，对应用抗生素来治疗细菌感染提出了警告。然而，靶向这种双相系统的药物可以同时杀死病原菌并最大限度的减少耐药性的出现。

5 TOLL样受体和维生素D依赖的抗菌肽反应

Toll样受体参与细胞的先天性免疫，并通过激活信号的级联反应来调节获得性免疫，从而抵抗侵入的微生物。最新的研究表明，Toll样受体能够介导宿主细胞清除胞内分枝杆菌。其机理为Toll样受体被激活的同时会诱导维生素D受体和维生素D-1水解酶基因表达上调，促进抗微生物肽的产生，从而更有效的杀死胞内结核分枝杆菌[30]。这项研究同时还揭示了维生素D在抵抗肺结核中的作用，并进一步解释了不同种族人群对结核分枝杆菌易感性的不同。非洲人皮肤上黑色素含量高，紫外线(UV)依赖维生素D3合成能力较低，抗菌肽的量也相应减少，因此当感染了结核分枝杆菌时，免疫系统固有的杀菌能力不足以抵抗病原菌，表现出了结核易感性。

6 结论和展望

结核分枝杆菌已经同人类共存并进化了数千年，由于抗生素的引入，使得长期建立的宿主和结核分枝杆菌之间平衡关系被打破。抗生素的使用无疑提高了人类化学治疗感染性疾病的能力，并挽救了无数人的生命，但短时间内接触大量的抗生素同时也加速了病原菌的进化，使其具备适应甚至是抵抗这些抗生素的能力。细菌先天性抵抗化学药物的能力远远超出人们的想象，除了抗结核药靶基因产生快速变异的能力外，结核分枝杆菌的后备基因帮助其抵抗大多数已存在的抗生素，甚至包括一些还没有在市场上出现的新药。细胞壁天然的抵抗力限制了抗菌药物接触到靶位，而药物反应调节器调控着许多具有抗生素抵抗作用的结构蛋白，组成了内部防御系统。除了抗药能力外，结核分枝杆菌还利用众多的分子机制来抵挡宿主的防御作用。这些药物抵抗系统其实提供了一些可能的新药靶位，同样也可能很快产生新的耐药机制。

目前，基因组学和蛋白质组学等分子生物学技术发展为抗结核药物的发现带来了前所未有的机遇。通过对结核分枝杆菌固有抵抗药物和宿主免疫防御分子机制的深入了解，来筛选靶位设计药物。同时，宿主体内复杂的环境决定了抗菌药物的治疗效果，宿主的免疫机制、基因易感性和营养状况都会影响治疗的结果和疾病的复发，因此将结核分枝杆菌的研究同宿主以及抗菌药物联系起来，作为一个整体来研究，将会取得更大的进展。

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